Способ стабилизации кининов вплазме крови

 

О П И С А Н И Е »833208

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советскых

Соцывлыстыческых

Респубпык

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61} Дополнительное к авт. свид-ву— (51) М. Кл з

А61 В ГО/00

G 01 N 33/48 (22) Заявлено 02.08.79 (21) 2823933/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет 02.12.77

Гееудерстеенньй немнтет

CGCP ао делам нзабретеннй н етхрмтнй (53) УДК 611-018..54 (088.8) Опубликовано 30.05.81. Бюллстень № 20

Дата опубликования описания 06.06.8! (72} Автор. изобретения. M. И. Курган (71) Заявитель

Львовский государственный медицинский и (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ КИНИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Изобретение относится к медицине, конкретно к методам исследования биологически активных веществ в крови.

Свободные кинины крови очень быстро образуются из кининогена под влиянием кининогеназ (калликреина), обуславливают в ничтожно малых концентрациях физиологические или патофизиологические реакции организма и очень быстро разрушаются кининазами. Из-за трудности эффективного подавления кининообразующей и кининразрушающей активности уровень свободных кининов в крови оценивают по изменению уровня кининогена. Однако отсутствие данных- об исходном уровне последнего в конкретной ситуации и постоянное изменение его, делают эту оценку весьма условной.

Известен способ стабилизации кининов в плазме крови 11J

Для стабилизации кининов по этому способу 0,.15 мл 5 /о-го трилона Б в охлажденной несмачиваемой пробирке через силиконированнукэ иглу из кровеносного сосу да доводят до 1 мл и центрифугируют при

Т 4С 20 мин при 4500 об/мин. Плазму отсасывают, на l,мл ее добавляют 8 мл

0,2%-ой уксусной кислоты, нагревают 30 мин на, кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и рН доводят до 2 соляной кислотой. Полученную жидкость насыщают поваренной солью и экстрагируют

5 дважды н-бутанолом, который затем испа1зяют в вакууме. Сухой остаток суспендируют и измеряют в нем уровень кининов на роге матки по сравнению со стандартным брадикинином.

Однако способ имеет ряд недостатков.

Первым из них является отсутствие подавления фоновой и спонтаннои кининобразующей активности. Кроме того, в процессе воспроизводства способа, охлаждением крови и плазмы и добавлением к плазме уксусной кислоты вызывается активация кининогеназ. Уровень свободных кининов в плазме крови в норме колеблется в пределах 8» к10 6 — 27 ° 10 6 г/л., т е. в количествах, которые в сотни раз превышакэт дозы брадикинина, вызывающие пороговый и в десятки раз дозы, вызывающие патофизиологический эффект. Поэтому выявляемые автором концентрации свободных хининов в плазме крови в норме являются резуль833208 титом действия активированных кинишненаз на кининоген вне организма и не отображают истинной ситуации в организме.

Цель изобретения — сохранение исходногО уровня кининов.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе стабилизации кининов в плазме крови путем добавления стабилизирующего раствора с последующим кипячением пробы, пробу крови сразу после ее забора смешивают со стабилиэируюшим раствором, содержашим 0,04 — 0,05 мл контрикала и 0,14 — 0,15 мл смеси, содержагцей

Трилона Б, r 4,5 — 5,0

Хлористого цинка, г 1,0 — 1,2

Дистиллированной воды, мм 100, Далее пробу центрифугируют, полученную плазму разводят дистиллированной водой в соотношении 1: и кипятят в течение

l — 2 мин, затем повторно центрифугируют.

Способ осуществляется следующим образом.

0,8 мл крови в момент забора смешивают с 0,2 мл стабилизатора, состояшего из следующих компонентов: 0,04 — 0,05 мл контрикала и 0,14 — 0,15 мл смеси, включающей

Трилона Б, г 4,5 — 5,0

Хлористогооцинка, г 1,0 — 1,2

Дистиллированной воды, мл 100.

Кровь забирают из сосуда силиконированной иглой в полиэтиленовую пробирку, перемешивают полиэтиленовой палочкой и центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин до получения безтромбоцитной плазмы. Плазму в пределах 35 мин от момента забора крови разводят 1: 1 дистиллированной водой и кипятят 1 — 2 мин на открытом огне. Прокипяченную плазму центрифугируют 5 мин при 3500 об/мин и в надосадочной жидкости определяют уровень свободных кининов биологическим способом на роге матки крысы.

В предлагаемом способе, нарядуь с предупреждением конкретной активации процессов кининообразования и частичным подавлением кининаз трилоном Б, в отличие от известного способа, уже в момент забора крови временно полностью подавляют кининобразование контрикалом и полностью окончательно подавляют кининразрушаюшую активность хлористым цинком и трилоном Б.

В отличие от 30 минутного прогревания на кипящей водяной бане с целью подавления кининразрушающей активности, применяют кипячение полученной плазмы на протяжении 1 — 2 мин на открытом огне в пределах до 35 мин после забора крови для окончательного подавления кининобразования. Указанные приемы обуславливают стабильное сохранение свободных кининов в плазме при Т 0 -- + 6 С на протяжении

5 — 6 сут. .Насадочная жидкость прокипяченной плазмы, в отличис. от сильнокислотной жид10

КК = 0,044 нг/мл

40 падения давления крови возрастает в 400—

500 раз и становится одинаковым в венозной и артериальной крови. Резкое увеличение уровня свободных кини нов отмечено при

50

Формула изобретения

ЭО кости, I!Ол )чу !vlой посл«обра ба Гки II,1 азм ы ио известному способу биологич««ки контактна, что позволяет прямо, оиред«ля гь кинины на роге матки крысы б«з ир«дварительного экстрагирования их н-бутанолом.

Определение концентрации свободных кининов в насадочной жидкости ирокиияценной плазмы проводят биоло ическим методом на роге матки крысы. Сначала определяют порог стандартногс> брадики нина (ПБ), используя его раствор в концентрации.

1 нг/мм. Затем определяют пороговое количество насадочной жидкости прокипяченной плазмы (ПП), вызываюшее сокращение рога.

Для расчета исходной концентрации свободных кининов в исследуемой плазме порог брадикинина в нанограммах делят на количество миллилитров надосадочной жидкости и умножают на 2,2, т. е. на коэффициент разведения плазмы в процессе обработки.

Например Г1Б = 001 нг; Г1П = 05 мл; отсюда концентрация свободных кининов (КК) в исследуемой плазме составит:

КК =Пц — ""- ° 2,2; КК = (0,01:0.50) 2,2 °

Afl нл

В случае высокого содержания кининов в надосадочной жидкости прокипяченной плазмы, последнюю разводят и полученный результат умножают сначала на кратность разведения, а после на коэффициент 2,2.

Определение стабилизированных предлагаемым способом свободных кининов показывает, что уровень их в плазме венозной крови собак в горме колеблется в пределах

55 10 — 75 10 г/л и в артериальной от

0,000 до 25 ° 10 г/л. Аналогичные результаты получены при обследовании здоровых людей. В условиях внутривенного введения собакам больших доз экстракта головного мозга, уровень свободных кининов в момент других патологических ситуациях в эксперименте и клинике.

Гlредлагаемый способ вниду его надежности и доступности может быть применен в клинической практике.

Способ стабилизации кининов в плазме крови путем добавления стабилизирующего раствора с последуюшим кипячением пробы, отличающийся тем, что, с целью сохранения исходного уровня кининов, пробу крови cpa3v после ее забора смешивают со стабилизирую1цим раствором, содержащим 0,04-833208

Составитель О. Ленчицкая

Техред А. Бойкас Корректор Ю. Макаренко

Тираж 687 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская иаб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор Е. Кннив

Заказ 3843/2

0,05 мл контрикала и 0,14 — 0,15 мл смеси включающей:

Трилона Ь, г 4,5 — 5,0

Хлористого цинка, г 1,0 — 1,2

Дистиллированной воды, мл IO0 далее пробу центрифугируют, полученную плазму разводят дистиллированной водой в соотношении I: 1 и кипятят в течение

1 — 2 мин, затем повторно центрифугируют.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе . 1. ОпаЬапуi А. Olaji4e. А. А simple

micromethod for the estimation of plasma

kinins.— «Pharm. Res Communs», 1970, № 2. р. 165 — 168.