Способ получения циклических пептидов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (»)849998 (61) Дополнительный к патенту.— (22) Заявлено 120975 (21) 2171806/23-04 (23) Приоритет— (32) 12. 09. 74 (51)М. Кл.

С 07 С 103/52 //

A 61 К 37/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (33) Сша (31) 505344

Опубликовано 23.07.81 Бюллетень М 27

Дата опубликования описания 230781 (53) УДК 547.964. . 4. 07 (088 ° 8) Иностранцы

Джон Лоренс Хьюз, Джей Кеннет СейЛер и Роберт Чунг-Хуан Лиу (США) : " ... =," 3

Иностранная фирма

"ApMop Фармасьютикал Компани" (США)

) (72) Авторы изобретения (7i) Заявитель (54),СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

Изобретение относится к способам. получения циклических пептидов с замкнутым дисульфидным мостиком, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине.

Известен способ замыкания дисульфидного кольца в пептиде, содержащем два цистеиновых остатка, окислением соответствующего нециклического пептида (1 ).

Основной недостаток известного способа состоит в том, что для его осуществления необходимо использование окислительных агентов, что может привести к загрязнению пептида продуктами его окислительной деструкции. и снижению, выхода целевого продукта.

Кроме того, при окислении дисульфида кроме нужного циклического мономера образуются параллельные и антипараллельные димеры, циклические или линейные высшие полимеры. В результате выход основного продукта снижается до 35%. 25

Цель изобретения — повышение выхода и упрощение процесса получения циклических пептидов.

Поставленная цель достигается тем, что.согласно способу получения циклических пептидов путем замыкания дисульфидного мостика в нециклическом пептиде, содержащем не менее двух цистеиновых остатков, применяют исходный нециклйческий пептид, один из цистеиновых остатков которого содержит свободную сульфгидрильную функцию, а второй — сульфгидрильную функцию, защищенную н-алкилтио группой, и выдерживают его в водном растворе, свободном от кислорода при рН от 5 до 10, в токе инертного газа °

Причем используют. водно-спиртовый раствор, в качестве инертного газа применяют азот, и процесс проводят при рН 7,5.

Нециклические пептиды, содержащие два цистеиновых аминокислотных остатка, которые являются промежуточными, имеют до отщепления защитных групп структуру 9х 5Z

I I

СУЬ- (А) Х вЂ” СЧ5 а после кислотной. обработки, проведенной для отщепления защитных групп, структуру Щ

- У9- (A) „- СЧ5, где A — аминокислотный остаток;

x — ноль или целое число;

Cys — цистеиновый остаток;

849998

R — н-алкилтио-группа, Вг — бензильная группа или ее производное.

Пептид имеет один цистеиновый остаток со свободной сульфгидрипьной функцией, второй цистеиновый остаток защищен н-алкилтио-группой. Такие пептиды выдерживают в растворе, лучше водном или спиртовом, при рЙ от 5 до

10 до тех пор, пока не пройдет самопроизвольная перегруппировка до соответствующего циклического дисульфидного пептида с вытеснением. н-алкилмеркаптана.

Пример 1. Синтез окситоцина.

Активация смолы.

5 г бензгидриламиновой смолы (BHA) с титром амина 0,43 мэкЫ/г помещают в реактор и обрабатывают следующими растворителями, используя каждый раз

20 мл порции и фильтруя после каждой обработки: метиленхлорид — 2 мин, 20 хлороформ — два раза по 2,мин, 10Ъ-ный триэтиламин в хлороформе — два раза по 5 мин, хлороформ — 2 мин, метиленхлорид — три раза по 2 мин.

Цикл 9. Сочетание. д

Перемешивают в течение 10 мин смолу . BHA, 20 мл метиленхлорида и 0,75 r (0,0043 моль) BOC-глицина. Затем в реактор загружают 4,3 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мэкв дициклогексилкарбодиимида на 1 мл раствора). Смесь перемешивают б ч. Смолу BOC-глицин-ВНА отфильтровывают и подвергают следующим последовательным 2 минутным промывкам, каждый раз фильтруя; метиленхлорид — (20мл х 2), метиловый спирт (20 мл х 2), метиленхлорид — (20 мл х х 2).

Ацетилиров ание.К® смоле добавляют со смесью 1,б мл уксусного ангидрида, 2,4 мл триэтиламина и 20 мл хлороформа и перемешивают в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтруют и смолу подвергают следующим промывкам, продолжая каждую в течение 2 мин, хлороформ(20 мл х 2), метиловый спирт — (20мл х х 2), метиленхлорид. — (20 кЯ х 3).

Нингйдриновая проба отрицательна.

С н я т и е з а щ и т ы. Смолу, защищенную ВОС, перемешивают 5 мин со смесью 12 мл трифторуксусной кислоты и 12 мл метиленхлорида. Фильтруют, и смолу перемешивают со второй смесью 12 мл трифторуксусной кислоты и 12 мл метиленхлорида в течение

30 мин. Смесь фильтруют, и смолу промывают следующими растворителями, беря по 20 мл:. метиленхлорида - 2 ра- Щ за по 2 мин, метиловый спирт - 2 раза по 2 мин, хлороформ — 2 раза по 2мин, 10%-ный триэтаноламин в хлороформе—

2 раза rio 5 и 10 мин, метиленхлорид—

2 раза по 2 мин. 6S

Для смолы ВНА-L-глицин титр амина или глицина,.составляет 0,384 мэкв амина или глицина на 1 г смолы.

Цикл 8. Сочетание.

L-Глициновую смолу, 20 мл метиленхлорида и 2,95 г (0,0038 моль) ВОС-L-лейцина перемешивают в воде в течение 10 мин. Затем в реактор добавляют

3,8 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мэкв дициклогексилкарбодиимида (DCC1) на 1 мл раствора или всего 0,0038 моль OCC1).

Смесь перемешивают 2 ч, затем реак.ционную смесь удаляют из реактора и смолу подвергают следующим последовательным 2-минутным промывкам, каждый раз фильтруя: метиленхлорид— (20 мл х 2), метиловый спирт — (20 мл х х 2), метиленхлорид — (20 мл х 2).

Нингидриновая проба отрицательна. .Снятие защиты.Вэтом цикле повторяют .методику снятия защитных групп, как в цикле 9 °

Ц и к л 7. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 8, но вместо лейцинового производного используют 0,82 г (0.,0038 моль) ВОС-L-пролина.

Ц и к л б. Сочетание и снятие защитных групп проводят в условиях цикла 8. Ацетилирование, как в цикле

9. Для сочетания применяют 1,07 г (0,0038 моль) BOC-S-этилтио-L-цистеин.

Цикл.5.Сочетание.

Пептидную смолу из цикла б дважды промывают, беря по 20 мл диметилформамида. Затем смолу перемешивают 24 ч с раствором 2,02 r (0,0057 моль) BOC-L-аспарагин-п-нитрофенилового эфира в 25 мл диметилформамида. Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают последовательным двухминутным промывкам по 20 мл следующими растворителями: диметилформамид, метиленхлорид, метанол, метиленхлорид. Промывки отделяют фильтрованием. Нингидриновая проба отрицательна.

Удаление защиты.Методика снятия защитных групп, как в цикле 8.

Ц и к л 4. Сочетание .проводят в условиях, описанных в цикле 5. Ацетилирование — как в цикле 9. Снятие защитных групп — как в цикле 8. Применяют следующее аминокислотное производное: 2,09 r (0,0057 моль) и-нитрофенилового.эфира ВОС-L-глутамина.

Ц и к л 3. Сочетание проводят в условиях, описанных в цикле 8. Сочетание повторяют, применяя смесь 10 мл диметилформамйда и 10 мл метиленхлорида, и такое же количество аминокислоты и дициклогексилкарбодиимида. Ацетилирование ведут, как в цикле 9.

Снятие защитных групп, — как в цикле 8.

Для реакции сочетания применяют О, 88 г (0,0038 моль) ВОС-L-изолейцина.

Цикл 2.Сочетание.

Пептидную смолу из цикла 3 промывают

849998 двумя последовательными порциями по

20 мл диметилформамида. Затем нептидную смолу перемешивают 10 мин со смесью 2,11 г (0,0057 моль) ВОС-о. -бензил-L-THPQ3HHB и 20 мл диметилформамида. Затем добавляют 5,7 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0057 моль

DCCl), и смесь перемешивают 16 ч, затем фильтруют. Пептидную смолу подвергают 2-минутным промывкам по 20 мл 0 каждая следующими растворителями по

2 раза: диметилформамид, метиленхлорид, метанол и метиленхлорид.

Сочетание повторяют, применяя половину указанного количества аминокислотных производных и дициклогек- 15 силкарбодиимида в метиленхлориде при перемешивании в течение б ч.

A ц е т и л и р о в а н и е.

Ведут, как в примере 9.

Снятие защитных 20 г р у и п. Ведут как в примере 9.

Ц и к л 1. Сочетание ведут, как в цикле 8. Сочетание повторяют, применяя половину указанного количества аминокислотного производного и дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде. Снятие защитных групп ведут, как в цикле 9. В первой реакции со-, четания применяют 1,3 г (0,038 моль)

ВОС-S-метоксибензил-L-цистеина.

По окончании цикла 1 пептидную смолу последовательно промывают двумя порциями по 20 мл н-гексана. Пептидное вещество извлекают из реактора и сушат в электровакуумной печи при 40ОС/0,1 мм рт.ст. в течение

24 ч. Вес блокированной пептидной смолы окситоцина 6,0 r.

О т щ е пление ф т о р и ст ы м в о д о р о д о м. 2 г высушенной пептидной смолы и 2 мл анизола 40 помещают в тефлоновый реактор снабженный магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием. Реактор охлаждают в бане с сухим льдом и ацетоном. В реактор конденсируют 15 мл газообраз- 45 ного фтористого водорода. Смесь перемешивают при ООC на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород испаряют при пониженном давлении. Остаток растирают с 4-я 25 мл порциями этилацетата. Пептид экстрагируют со смолы 2х50 мл порциями ледяной уксусной кислоты. Экстракт лиофилизируют, получают 486 мг отщепленного пептида.

Циклизация.пептида доокситоцина.200мг сырого пентида растворяют в 50 мл не содержащей кислорода дистиллированной воды с добавкой 1 мл ледяной уксусной кислоты. рН раствора домодят до 7,5 добавлением концентриро- ф) ванной гидроокиси аммония. Смесь перемешивают в герметичном сосуде в токе азота 24 ч. К этому времени в выходящем азоте уже не. содержится меркаптана. Содержание этилмеркаптана $5 в выходящем азоте определяют, пропус- кая ток газа через раствор реагента

Эллмана. рН реакционной смеси доводят до 3,5 добавлением ледяной уксусной кислоты. Лиофилиэируют и получают твердый остаток.

О ч и с т к а сырого о к с и т о ц и н а. Твердый остаток растворяют в 0,5 н. уксусной кислоте и чистят, пропуская через колонку, заполненную Сефадексом G 25 (тонкий), и элюируют 0 5 н. уксусной кислотой.

Окситоциновую фракцию иэ этой колонКи собирают и лиофилизируют, получают

54 мп белого осадка. Осадок вновь растворяют в 0,5 н.уксусной кислоте и чистят гель-фильтрацией через Сефадекс G-25 (тонкий), элюируют 0,5 н ° уксусной кислотой. Окситоциновую фракцию собирают, лиофилизируют, получают пушистый белый осадок.

Анализ продукта показал следующие количества аминокислот: 61у 1,0; Leu

0,98; Pro 0,97; Asp 0,89; Gill 0,84;

lie 0,74, Tyr 0,72. Теоретическое количество должно составлять 1,0.

Содержание Cys не определяют, так как эта кислота разрушается при анализе.

Биологическая активность полученного продукта составляет 305,4 единицы ка 1 мг.

Этот способ может быть также при енен к синтезу соматостатина.

Пример 2. Сии те з че ловеческогокальцит о н и н а.

A к т и в а ц и я с м о л ы. 4 r бенэгидриламиновой смолы (BHA) с аминовым титром 0,55 мэкв/г загружают в реактор и обрабатывают 20 мл следующих растворителей, фильтруя после каждой промывки. метиленхлорид

2 мин, хлороформ два раза по 2 мин, 10%-ный триэтил амий в хлороформе два раза по 5 мин, хлороформ — 2 мин,, метиленхлорид три раза по 2 мин.

Ц и к л 32. С о ч е т а н и е.

Смолу ВНА,.20 мл метиленхлорида и

0,95 г (0,0044 моль) BOC-L-пролина перемешивают 10 мин. В реактор добавляют 4,4 мл метиленхлоридного раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв

0CCl на 1 мп раствора) и смесь перемешивают б ч. Реакционную смесь отфильтровывают, и смолу ВОС-L-пролил-BHA,подвергают последовательным промывкам, продолжительностью 2 мин по 20 мл растворителя, каждый раэ фильтруя: метиленхлорид - 2 раза, метиловый спирт — 2 раза, метиленхлорид — 2 раза.

Ацетилирование.

Смолу перемешивают со смесью 1,5 мл триэтиламина, 1 мл уксусного ангидрида и 20 мл хлороформа в течение

2 ч. Реакционную смесь отфильтровывают, и смолу промывают последовательно по 2 мин по 20 мл следующими растворителями. хлороформ — 2 раза, 849998 метиловый спирт — 2 раза и метиленхлорид — 3 раза. Нингидриновая проба отрицательна.

С н я т и е з а щ и т н ы х г р у п и. Защищенную BOC смолу перемешивают 5 мин со смесью 12,5 мл трифторуксусной кислоты и 12,5 мл метиленхлорида. Смесь фильтруют, и смолу перемешивают со второй смесью, состоящей из 12,5 мл трифторуксусной кислоты и 12,5 мл метиленхлорида в течение ,30 мин. Реакционную смесь фильтруют, и смолу подвергают последовательным промывкам по 20 мл: метиленхлоридом—

2 раза по 2 мин, метиловым спиртом

2 раза по 2 мин, хлороформом 2 раза по 2 мин, 10%-ным тризтиламином в хлороформе 2 раза по 10 мин, хлороформом 2 раза по 2 мин, метиленхлоридом 2 раза по 2 мин.

Смолу L-пролин-BHA титруют для ,установления титра амина или пролина, Эта величина составляет 0,494 мэкв амина или пролина на 1 r смолы.

Ц и к л 31. С о ч е т а н и е.

L-пролильную смолу, 20 мл метиленхлорида и 0,83 r (0,0044 моль) ВОСаланина перемешивают 10 мин. Затем в реактор добавляют 4,4 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мзкв DCC1 на 1 мл раствора или всего 0,0044 моль DCC1), и смесь перемешивают 2 ч. Реакционную смесь отфильтровывают и полученную BOC-L-аланил-L-пролил-BHA смолу подвергают последовательным 3-минутным промывкам по 20 мл, каждый раз фильтруя: метиленхлоридом 2 раза, метиловым спиртом 2 раза, метиленхлоридoM 3 раза. Нингидриновая проба отрицательна.

Ц и к л ы 30-26. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланинового производного применяют следующие аминокислотные производные: цикл 30 — 0,77 г (0,0044 моль) BOC-глицина, цикл 29

0,95 г (0,0044 моль) ВОС-1-валина, цикл 28 — то же вещество, что в цикле 30, цикл 27 — 1,02 г (0,0044 моль)

ВОС-L†- изолейцина, цикл 26 — то же вещество, что в цикле 31.

Ц и к л 25. С о ч е т а н и е.

Пептидную смолу из цикла 26 дважды промывают 20 мл порциями диметилформамида. Затем ее перемешивают 10 мин со смесью 2,04 r (0,0066 моль) ВОС-р-бензил-L-треонина и 20 мл диметилформамида. Добавляют 6,6 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0066 моль DCCl), и смесь перемешивают б ч. Реакционную смесь фильтруют. Пептидную смолу подвергают 2 минутным промывкам порциями по 20 мл в следующих растворителях: диметилформамид, метиленхло.рид, метиловый спирт, метиленхлорид.

Нингидриновая проба отрицательна.

65 меняют следующие аминокислотные -производные: цикл 16 — 1,17 r(0,0044 моль)

BGC-L-фенилаланина, цикл 15 — 1,42 r (0,0044 моль) -бензилового эфира

BOC-L-аспартовой кислоты.

Ц и к л 14. Ведут так же, как цикл 24.

С н я т и е з а щ и т ы. Ведут как в цикле 32.

Ц и к л 24..С о ч е т а н и е, Пептидную смолу из цикла 25 дважды промывают 20 мл:порциями диметилформамида. Затем смолу перемешивают

24 ч с раствором 2,,42 г (0,0066 моль) и-нитрофенилового эфира ВОС-L-глутамина в 25 мл диметилформамиде. Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают 2-минутным промывкам двумя последовательными порциями по 20 мл каждая в следующих растворителях: диметилформамид, метиленхлорид, метанол, метиленхлорид. Каждый растворитель отфильтровывают. Нин 5 гидриновая проба отрицательна.

С н я т и е з а щ и т ы. Ведут, как в цикле 32.

Ц и к л 23. С о ч е т а н и е.

Пептидную смолу из цикла 24 перемешивают. 10 мин с 1,42 г (0,0066 моль)

BOC-L-пролина и 20 мл.метиленхлорида, Добавляют 6,6 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0066 моль DCCl), и смесь перемешивают 16 ч. Реакционную смесь отфильтровывают, и пептидную смолу подвергают последовательным промывкам по 20 мл каждая, продолжительностью 2 мин следующими растворителями: метиленхлорид, метиловый

30 спирт, метиленхлорид. Каждую промывку фильтруют, Нингидриновая проба отрицательна.

С н я т и е з а щ и т ы. Ведут как в цикле 32.

35 Ц и к л 22. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 23, но при сочетании вместо ВОС-L-пролина применяют 1,75 г (0,0066 моль) ВОС-L-фенилаланина.

4р U, è к л ы с 21 п о 18. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланинового производного применяют следующие аминокислотные производные: цикл 21—

1,36 r (0,0044 моль) ВОС-о-бензил-L45 -треонина, цикл 20 — 1,71 г (0,0044 моль) BOC-й-(im)-карбобензилокси- L-гистидина, цикл 19 — 1,17 r (0,0044 моль) BOC-L-фенилаланина, цикл 18 " 1,67 r (0,0044 моль) BOC50 -f-карбобензилокси- -лизина.

Ц и к л 17 ° Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 24, но вместо глутаминового производного применяют 2,33 г (0,0066 моль) п-ниф55 тофенилового эфира ВОС-L-аспарагина.

Ц и к л ы 16 и 15.Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланилового производного при849998

Ц и к л 13. Ведут так же, как цикл 21.

Ц и к л 12. Сочетание и снятие защиты проводят в условиях, описанных в цикле 15, но вместо треонинового производного берут 2, 45 г (0,0066 моль).

ВОС-о-бензил-L-.тирозина, и перемешивают смесь 16 ч.

Ц и к л 11. Ведут так же, как цикл 25.

Ц и к л ы 10-7. Сочетание и снятие защит ведут, как в цикле 31, но 19 в реакции сочетания вместо BOC-L-аланина берут следующие аминокислотные производные: цикл 10 — 0,77 г (0,0044 моль) ВОС-глицина, цикл 9

1,02 г (0,0044 моль) ВОС-L-лейцина, цикл 8 — 1,1 г (0,0044 моль) ВОС-L-метионина, цикл 7 — 1,24 r (0,0044 моль) ВОС-S-этилтио-L-цистеина.

Ц и к л 6. Ведут так же, как 20 цикл 25 .

Ц и к л ы 5 и 4. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо ВОС-L-аланина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 5 — 1,3 г (0,0044 моль) BOC-о-бензил-L-серина, цикл 4 — 1,02 r (0,0044 моль) ВОС-L-лейцина.

Ц и к л 3. Условия проведения те же, что и в цикле 17.

Ц и к л ы 2 и 1. Сочетание и сня- З0 тие защит ведут как в цикле 31, но вместо ВОС- -аланина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 2 — 0,77 г.(0,0044 моль) ВОС-глицина, цикл 1 — 1,5 г (0,0044 моль) З5

ВОС-S-п-метоксибензил-L-цистеина.

По окончании цикла 1 пеитидную смолу два раза промывают 20 мл порциями н-гексана. Пептидное вещество выгружают из реактора и сушат в 40 электровакуумной печи при 40ОС и

0,11 мм рт.ст. в течение 24 ч. Вес блокированной пептидной смолы человеческого кальцитонина — 11 г.

О т щ е п л е н и е ф т о р и с т ы м в о д о р о д о м. 2 r высу4 щенной пептидной смолы и 2 мл анизола помещают в теплоновый реактор, снабженный магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием, и охлаждаемый в бане с ацетоном и сухим льдом. В реактор конденсируют 15 мл газообразного фтористого водорода. Смесь перемешивают при 0 С на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород отгоняют при пониженном давлении. Остаток растирают с 4х25мл этилацетата. Пептид экстрагируют из смолы 2х50 мл ледяной уксусной кислоты. Экстракты лиофилизируют и получают 1063 мг отщепленного пеп- щ тида.

Циклизация пептида до человеческого кальцитонина. 1000 мг сырого пеп.гида растворяют в 250 мл не содержащей кислорода дистиллированной 65 воды с 1 мл ледяной уксусной кислоты, рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокиси аммония. Смесь перемешивают в герметичном сосуде в токе азота в течение

24 ч. К этому времени в выходящем азоте уже не содержится этилмеркаптан.

Содержание этилмеркаптана в выходящем азоте определяют пропусканием азота через раствор реактива Эллмана. рН реакционной смеси доводят до 3,2 добавлением ледяной уксусной кислоты.

После лиофилизации получают твердый продут весом 985 мг.

Очистка сырого человеческого кальцитонина. Твердый продукт растворяют в 0,5 н.уксусной кислоте и чистят гель-хроматографией на Сефадекс G-25 (тонкий), элюируют 0,5 н. уксусной кислотой. Фракцию человеческого кальцитонина из этой колонки собирают и лиофилизируют, получают белый пушистый осадок, который растворяют в

0,05 М водном ацетате аммония (pH=5). рН раствора доводят до 5 и раствор чистят ионнообменной хроматографией на колонне SR-Сефадекс G-25. Продукт элюируют буфером — ацетатом аммония.

Фракцию, содержащую человеческий кальцитонин, дважды лиофилизируют, получают пушистый белый осадок. Установлено, что это вещество биологически и химически эквивалентно продукту, описанному в литературе. Аминокислотный анализ (кислотный гидролиз) дает следующие количества аминокислот (теоретические величины даны в скобках); Lys 1,02 (1); His 0,99 (1)1

Asp 3,28 (3); Thz 5,21 (5); Ser

0,74 (1); Glu 1,95 (2); Gly 4,33 (4);

Ala 2,03 .(2); Val 1,04 (1); Met

0,86 (1); I1е 1,07 (1); ец 2,24 (2);

tyr 0,7 (1); Phe 3,0 (3). Величины для Pro u Cys не определяют. Биологическая активность составляет 100 HRC единиц на 1 мг.

Этот способ может быть применен в синтезе вазопрессина, свинного кальцитонина, бычьего кальцитонина.

Пример 3. Синтез кальцитонина лосося.

Активация смолы.5г смолы BHA с титром по амину 0,61 мэкв/г помещают в реактор и обрабатывают растворителями, каждый раз беря по

25 мл соответствующего растворителя и фильтруя реакционную массу после каждой обработки: метиленхлорид—

2 мин, хлороформ — 2 мин по два раза, 10Ъ-ный триэтиламин в хлороформе—

5 мин по два раза, хлороформ — 2 мин, метиленхлорид — 2 мин по три раза.

Ц и к л 32. С о ч е т а н и е.

Смолу ВНА, 25 мл,метиленхлорида и

1,29 r (0,006 моль) BOC L-пролина перемешивают 10 мин, добавляют 6,0мл раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв DCC1 на 1 мл раствора) в метиленхлориде, и смесь перемешивают

849998

6 ч. Смолу НОС-пролин-ВНА отфильтровывают и подвергают следующим последовательным 2-.минутным промывкам:

- метиленхлоридом (2х25 мл), метиловым спиртом (2х25 мл) и вновь метиленхлоридом (Çx25 мл). После каждой промывки смолу фильтруют„

Ацетилирование.К смоле добавляют смесь 1,5 мл триаэтиламина, 1 мл уксусного ангидрида и

25 мл хлороформа и перемешивают в течение 2 ч, затем фильтруют и смолу промывают следующими растворителями: хлороформом (2х25 мл), .метиловый спирт (2х25 мл), метиленхлорид (Зх25 мп). Каждая промывка длится

2 мин.

Удаление защитных г р у и и. Смолу, защищенную ВОС, перемешивают 5 мин в смеси 15 мл трифторуксусной кислоты и 15 мл метиленхлорида, фильтруют, вновь перемешивают с этой же смесью растворителей в течение 30 мин. Фильтруют и смолу промывают растворителями, беря их по 25 мл: метиленхлоридом (2х25 мл), метиловым спиртом (2х25 мл), хлороформом (2х25 мл). Каждая промывка продолжается 2 мин, 10Ъ-ным триэтиламином в хлороформе (2х25 мл)—

10 мин, хлороформом и метиленхлоридом (2x25 мл). Две последние промывки также продолжаются 2 мин. Для смолы L-пролин-BHA устанавливают титр амина или пролина. Эта величина равна 0,55 мэкв амина или пролина на

1 г смолы.

Ц и к л 31. С о ч е т а н и е.

Смесь, содержащую смолу L-пролина, 25 мл метиленхлорида и 1,7 г (0,0055 моль) ВОС-о-бензил-L-треонина перемешивают 10 мин. Затем в раствор добавляют 5,5 мл раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв DCC1 на

1 мл раствора или всего 0,0055 моль

DCCl) в метиленхлориде, и смесь перемешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтруют, и смолу подвергают следующим последовательным 2-минутным промывкам: метиленхлорид (2x25 мл), метиловый спирт (2х25 мл), метиленхлорид (Зх25 мл). Нингидриноэая реакция отрицательна.

Снятие з а щ и т н ы х г р у п п. Проводят в условиях, описанных для цикла 32.

Ц и к л ы 30-27. Применяют методику сочетания и удаления защитных групп,. как в цикле 31, но вместо треонинового производства используют следующие аминокислотные производные: цикл 30 — 0,97 г (0,0055 моль) ВОС-глицина цикл 29 — 1,62 г (0,0055 моль) НОС-о-бензил-L-серина; цикл 28 — то же соединение,что и в цикле 30; цикл 27 — то же соединение, что и в цикле 31.

Ц и к л 26. С о ч е т а н и е.

Пептидную смолу из цикла 27 промывают диметилформамидом (Çx25 мл), Затем смолу перемешивают 24 ч с раствором

2,9 г (0,008 моль) п-нитрофенилового эфира BOC-L-аспарагина в 35 мл диметилформамида. Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают

2-минутным промывкам последовательно следующими растворителями: диметилформамид, метиленхлорид, метанол, .метиленхдорид, каждый раз беря по

25 мл. Растворитель отделяют фильтрованием. Нингидриновая проба отрицательна.

Удаление з а щ и т н ы х г p y п п. Проводят в условиях, описанных для цикла 32.

Ц и к л 25, Сочетание и удаление защитных групп осуществляют в условиях, описанных для цикла 31, применяя те же вещества в таких же количествах.

20 Ц и к л 24. С о ч е т а н и е.

Пептидную смолу из пикла 25 промывают двумя последовательными порциями по

25 мл диметилформамида и перемешивают

10 мин со смесью 3,43 r (0,08 моль)

ВОС-К-у- -аргинина в 25 мп диметилформамида. Затем добавляют 8 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль DCC1),. смесь перемешивают 6 ч, фильтруют.

gg Пептидную смолу подвергают двухминутным промывкам следующими растворителямиг диметилформамид (2x25 мл), метиленхлорид (2х25 мл), метиловый спирт (2х25 мл), метиленхлорид (2x25 мл). Нингидриновая проба отрицательна.

Удаление защитных г р у и п. Проводят в условиях,описанных для цикла 32.

40 Цикл 23. Сочетание.

Пептидную смолу, полученную в цикле

24, перемешивают 10 мин с 1,77 г (0,008 моль) ВОС-L-пролина и 25 мл метиленхлорида . Добавляют 8 мл

45 дициклогексилкарбадиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль DCC1) смесь перемешивают 6 ч, фильтруют и пептидную смолу подвергают двухминутным промывкам следующими растворителями: метиленхлорид (2х25 мл), метиловый спирт (2x25 мл), метиленхлорид (2х25 мл). После каждой промывки смолу отфильтровывают. Нингидриновая реакция отрицательна.

Удаление защитных г р у п и. Проводят в условиях, описанных в цикле 32.

Ц и к л ы 22 и 21. Условия, в которых проводят сочетание и удаление защитных групп, описаны в цикле 24, 40 но в реакции сочетания вместо BOC-.L-пролина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 22—

2,97 г (0,008 моль) НОС-о-бензил-L-тирозина, цикл 21 — 2.47 г

65 (0,008 моль) BOC-о-бензил-L-треонина.

13

849998

ЗО

Удаление защитных

r р у п п. Проводят, как описано в цикле 32.

Ц и к л 7. Методика из цикла 31, но при сочетании вместо треонинового производного применяют 1,55 г (0,0055 моль) BOC-S-этилтио-L-цистеина.

IJ, и к л б. Вещества и методика описаны в цикле 31.

Ц и к л 5. Вещества и методика описаны в цикле 29.

Ц и к л 4. Вещества и методика описаны в цикле 19.

Ц и к л 3. Вещества и методика описаны н цикле 26.

Ц и к л 2. Вещества и методика описаны в цикле 29.

65

Ц и к л 20. Ме ."одика та же, что описана в цикле 26, но вместо аспарагинового производного применяют 3,0 r (0,008 моль) и-нитрофенилового эфира

ВОС-L-глутамина.

Ц и к л ы 19-15. Методика та же, что описана в цикле 31, но вместо треониновых производных берут следующие аминокислотные производные:

1цикл 19 — 1,37 г (0,0055 моль) BOC- -лейцина цикл 18 — 2 09 г

I I

10 (0,0055 моль) BOC-L-карбобензилокси-L-лизина цикл 17 — 2,58 г (0,0055моль)

ВОС-N-(im)-карбобензилокси-б-гистидина цикл 16 — как в цикле 19, цикл 15 — 1,85 г (0,0055 моль)- у -бензилового эфира ВОС-L-глутаминовой 15 кислоты.

Ц и к л 14. Условия реакции описаны в цикле 20.

Ц и к л 13. Методика такая же, как в цикле 23, но вместо пролоновых 20 производных берут в реакцию сочетания

2,36 г (0,008 моль) ВОС-о-бензил-1.—

-серина.

Ц и к л ы 12-9. Методика такая же, как в цикле 31, но в реакцию сочетания вместо треонинового производного берут следующие аминокислотные производные: цикл 12 — то же ве щество, что в цикле 19, цикл 11 то же вещество, что в цикле 13; цикл 10 — то же вещество, что.и в цикле 30, цикл 9 — то же вещество, ч.о и в цикле 19.

Ц и к и 8. С о ч е т а н и е.

Пептидную смолу, полученную в цикле

9, перемешивают 10 мин с 1,79 г

35 (0,008 моль) ВОС-L-валина и 25 мл метиленхлорида. Затем добавляют 8 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль

DCC1), и смесь перемешивают 16 ч. 40

Пептидную смолу отфильтровывают и подвергают 2-минутной промывке следующими растворителями: метиленхлорид (2х25 мл), метиловый спирт (2х25 мл), метиленхлорид (2х25 мл). 45

После каждой промывки смолу Отделяют фильтрованием.

Ц и к л 1. Методика описана в цикле 31, но вместо треонинового производного применяют 1,88 r (0,0055 моль)

ВОС-б-п-метоксибензил-L-цистеина, По окончании цикла 1 пептидную смолу промывают н-гексаном (2х25 мл),. отфильтровывают и сушат в электрической вакуумной печи при 40 С и давлении 0Ä1 мм рт.ст. в течение 24 ч, Расщепление ф т ор и с т ы м в о д о р о д о м. 16 r смеси сухой пептидной смолы и 16 мл анизола помещают в реактор из тефлона, снабженный покрытой тефлоном магнитной мешалкой..Реактор: охлаждают в бане из сухого льда и ацетона и конденсируют в нем 100 мл фтористого водорода..Эту смесь перемешивают при 0 C на ледяной бане в течение

1 ч. Фтористый водород упаривают при пониженном давлении. Остаток расти- рают в этилацетате (бх100 мл). Пептид экстрагируют 800 мл 0,1 M водного раствора уксусной кислоты.

Циклизация пептида н лососевый кальцитонин, Водно-уксуснокислый эКстракт пептида, полученного после отщепления смолы фтором водорода, разбавляют до 1,5 л 700 мл дистиллированной воды, рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокиси аммония, Раствор перемешивают в герметичном сосуде н токе азота в течение 24 ч. За это время весь отщепившийся этилмеркаптан уходит с током азота. Содержимое этилмеркаптана н токе азота определяют с помощью;реагента Эллмана, рН реакционной смеси доводят до 5,0 ледяной уксусной кислотой.

Очистка сырого лососевого кальцитонина. 1,5 л полученного раствора с рН 5,0.концентрируют с помощью ионнообменной колонки SD-Сефадекс G-25.

Получают 75 мл концентрата в 0,5 М растворе хлористого натрия, его обессоливают, чистят гель-фильтрацией через Сефадекс 0-25 (мелкий), элюируют 0,03 М водной уксусной кислотой.

Фракцию лососевого кальцитонина из этой колонки донодят до рН 6,0 раствором гидроокиси аммония. Раствор чистят ионнообменной хроматографией на колонке, заполненной Ватман

СМ 52. Для элюирования используют аммонийацетатный буфер. рН фракции лососевого кальцитонина из колонки доводят до 5,0 ледяной уксусной кис- лотой. Раствор концентрируют на ионнообменной колонке с Сефадексом

G-25. 30 мл концентрата, выведенного из колонки 0,5 М раствором хлористого натрия, обессолинают гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-25 (тонкий). Очищенную фракцию лососеного кальцитонина сушат вымораживанием. Продукт получают в виде пушистого белого твердого вещества.

849998

Составитель В. Волкова

Техред М. Рейв ес Корректор М. Шароши

Редактор Н. Егорова

Заказ 6139/82 Тираж 443 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий.113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Аминокислотный анализ (кислотный гидролиэ) дает следующие количества аминокислот (теоретические величины даны в скобках): Arg 1,65 (1); Asp

1,84 (2); Glu 3, 14 (3); Gly,3,06 ();

His 0 94 (1) р Leu 5,01 (5) 3 (Ув 1,94 (2); Pro 2,11 (2); Ser 3,86 (4);

Thr 5,15 (5); Tyr 0,85 (1); Val

0,95 (1) .

Содержание Cys не определяют.

Пример 4. Методику из примера 3 повторяют, применяя те же вещества, в таких же количествах при всех равных условиях, насколько это практически возможно, но в цикле 24

ВОС-N-тозил-L-тироэин заменяют 2,5 r (0,008 моль) ВОС-N-нитры-L-аргинина.

Полученные результаты почти идентичны тем, что описаны в примере 3.

Пример 5. Повторяют методику примера 3, применяя те же вещества, в тех же количествах и при тех же условиях,но в цикле 22 вместо ВОС-о-бензил-L-тирозина берут 3,45 г (0,008 моль) BOC-o-2-бромбензилоксикарбонил-L-тирозина. Результаты аналогичны полученным в примере 3.

Пример 6. Все методики, вещества и условия применяют как в примере 4,но и в циклах 18, и 11 Вбс-Я-бензилоксикарбонил-L-лизин заменяют 2,28 r 0,0055 моль ВОС-6= 2-хлорбенэил-оксикарбонил-L-лизином. Получают результаты, совпадающие с описанными в примере 3,.

ФорМула изобретения

1. Способ пблучения циклических пептидов путем замыкания дисульфидного мостика в нециклическом пепти-. де, содержащем не менее двух цистеиновых остатков, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения процесса, применяют исходный нециклический пептид, один иэ цистеиновых остатков которого содержит свободную сульфгидрильную функцию, а второй - сульф15 гидрильную функцию, защищенную н-алкилтио-группой, и вццерживают его в водном растворе, свободном от кислорода при рН от 5 до 10, в токе инертного газа.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю—

20 щ и и L я тTеeмM, что применяют. водно-, спиртовый раствор.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве инертного газа применяют азот.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что процесс проводят при рН 7,5. йсточники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шредер Э., Любке К. Пептиды, N. "Мир", 1967, с. 350.