Циклический аналог брадикинина,обладающий пролонгированным гипотензивным действием
ЦИКЛИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ВРАДИКИ НИНА ФОРМУЛЫ г Лтд-Рго- Pro-dty-Phe- Йег- Pro - Ptic-Лгд i Обладающий пролонгированиьм гйпотензианмм действием. (Л
СООЭ СОВЕТСНИХ
РЕСПУ6ЛИК . (1Е (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
re ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИй (21) 2964712/04 (22) 28.07.80 (46) 15.09.&3. Бюл. 9 34 (72) Ф.К. Мутулис, Г.И. Чипенс и Н.В. Мышлякова (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза
AH Лат.CCP (53) 547 964.4.07(088.8) (56) 1. Дзизинский A.A., Гомаэков О.A. Кинины в физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы . Новосибирск, 1976, с. 89.
2. D ° A ° NcCarthy, D.Е. Potter, Е.D. Nicolaides.An in vivo estimation of the potencies and half lives
of synthetic bradykinin and Kallidin-J. Pharm Exp. Ther ° 1965, 148,117.
3. Пасхина Т.С. Биохимические основы патологии сердечно-сосудистой системы (механизмы образования, обмен и роль при сосудистых патологиях кининов плазмы крови) — В кн. Молекулярные основы патологии под редакцией В.Н. Ореховича, М., Медицина, 1966, с. 123.
4; Авторское свидетельство СССР по заявке )! 2555261/23-04, кл. С 07 С 10,3/52, 1977.
5. Шредер Э. Любке К. Пептиды, ч, 1, М., Мир, 1967, с. 112,116. ц511 С 07 С .103/52 А 61 К 37/62 (54) (57) ЦИКЛИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ВРАДИКИНИНА ФОРМУЛЫ Ay — Ртв- Р о-б!у — Р1с — 1 — Pro — РЪе -l ó 1 обладающий пролонгированньи гипотеизивным действием.
892871
Изобретение относится к синтезу нового соединения - циклическому аналогу брадикинина, обладающему пролонгированным гипотензивным действием, которое может найти применение в биологии и медицине.
Брадикииин и другие пептиды, имеющие аминокислотную последовательность брадикинина, широко распросранены в живой природе и выполняют важные функции регулирования биохи- 10 мических и физиологических процессов в организмах животных и человека. С нарушением динамики образования и расщепления брадикинина и родственных ему пептидов связаны раз- )5 личные заболевания и патологйческие состояния человеческого организма (1), Однако несмотря на высокую биологическую активность брадикинин не нашел применения в медицине для лечения этих нарушеннй вследствие кратковременности его действия-(период полураспада брадикинина в организме 30 с) f2), а также из-за некоторых нежелательных побочных янлений Г1, 3) .
Известен циклический аналог брадикинина $4), обладающий пролонгированным гипотензивным дейстнием (продолжительность эффекта 2 ч).
Однако при его применении кровяное давление начинает частично восстанавливаться уже через 5-10 мин после его введения °
Цель изобретения — расширение арсенала средств воздействия на живой 35 организм.
Поставленная цель достигается описываемым,циклическим аналогом брадикинина формулы
40 обладающим пролонгированным гипотен- 45 зивньн4 действием.
Способ получения описываемого соединения основан на известных методах пептидной химии, например методе активированных эфиров, с нсполь- 5р зованием блокирования функциональных групп и последующего деблокирования . известными приемами (4,5J .
В приведенных примерах для синтеза использованы производные аминокислот, поставляемые фирмой Reanal (Венгрия). Упаривание растворов проводят в вакуумном испарителе при 30 С. Температуры-плавления, которые определены в открытых капиллярах, приведены беэ исправления.
Индивидуальность полученных соединений проверена с помощью тонкослой ной хроматографии на пластинках Si1ufol или Merck . Принедены хроматографические подвижности 65
R на пластинках Silufol UV-z>4
Ф в следующих системах: А — хлороформэтанол-этилацетат-уксусная кислотавода (85:5:8:2:0,25); Б — хлороформэтанол-Ч.бутанол-этилацетат — вода (10:6:4:3:1);  — хлороформ-метанолвода (40:30:5); à — H ° бутанол-уксусная кислота — вода (4:1:1); Š— этилацетат-пнриднн-уксусная кислота вола (5:5:1:3), а также электрофоретическая подвижность по отношению к гистидину Е з на бумаге И -16, в
1 N или 5 N уксусной кислоте. Пятна веществ обнаруживают осмотром хроматограмм в ультрафиолетовом свете, а также опрыскиванием нннгндридом, выдерживанием в парах иода, реагентом Сакагучн или при помощи хлора и реагента бензндина. Для идентификации соединений использовали .спектры
ПМ при 60 МГц, снятые на приборе Perkin-Elmer R 12A, а также спектры при 90 МГц, полученные на приборе,Bruker WH-90 . Аминокислотный анализ выполнен на анализаторе Biocal BC-200 после гидролиза пептидов н запаянной ампуле при
110 С н течение 24 ч.
Хроматографическая очистка промежуточных продуктов осуществлена на модифицирован ном приборе Jobin
Yron Chro matospa К с использованием силикагеля Н 60 фирмы Merck .
Пример 1. n --Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонилфенилаланилбензилсерилцролина (3) °
К раствору 10,3 r (22,3 ммоль) пентафторфенилоного эфира трет-бутоксикарбонилбензилсерина и 6,7 г
{23 4 ммоль) гидрохлорндап -нитробензилового эфира пролина н 200 мл диметилформамида добавляют триэтиламин до рН 8. Смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растворяют н смеси 100 мл эфира н 100 мл -воды. Органический слой отделяют, промывают 100 мл 10Ъного раствора бикарбоната калия, затем
100 мл 10Ъ-ного раствора бисульфата калия, сушат над безводным сульфатом магния, фильтруют, упаривают.
Получают масло, содержащее и -нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбоннлбензилсерилпролина (1), R f(A)
0,95, Rc (В) = О, 77, Ry (В) =О, 95, Н (Г) =О, 76 и пентафторфенол. его растворяют в трифторуксусной. кислоте, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, затем упаринают.
Остаток, содержащий трифторацетат
П-нитробензилоного эфира бензилсернлпролина (2), нейтрализуют триэтиламином до РН 8, добавляют 10 и (23,2 ммоль) пентафторфенилового эфира трет-бутоксикарбоннлфенилаланина. Выдерживают 1 ч прн комнатной температуре, затем добавляют 1 мл р-диметиламиноэтиламина. Спустя
892871
10:мин смесь нейтрализуют уксуснои кислотой до рН 6, упаривают, остаток растворяют в смеси 100 мл эфира и 100 мл воды, эфирный слой отделяют, промывают 100 мл 10%-ного раствора бикарбоната калия, 100 мл 5
10%-ного бисульфата калия, затем
100 мл воды. Добавляют 50 мл бензола, упаривают, полученное темнокоричневое масло очищают хроматографически (700 r силикагеля,. элюиру- (Q ют сначала смесью гептан-этилацетат (5:1), затем хроматографической сис. темой (A). После упаривания элюата получают светло-коричневое масло.
Выход 9,7 r (64,5%). Для аналитичес ких целей небольшую часть масла закристаллиэовывают растиранием с гексаном. (Ю) = -29,1О(с.l, диметилформамид). Rg(A) 0,94, R (Й)=0,77, Rg(В) = 0,96, Rg(Г) 0,81 .
Пример 2..Трифторацетат
ll-нитробензилового эфира Фенилаланилбензилсерилпролина (4).
9,0 г (13,3 ммоль) растворяют в
50 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают при 20 С, остаь ток растирают со 100 мл безводного эфира. Получают масло, выход 8,9 г (97%). Для аналитических целей небольшую часть масла закристаллизо- 30 вывают растиранием с гексаном. (Ж) = -16,3 >(с Z,äèìåòèëôoðìàìèä);
И
Е >, 0,61 (1 N уксусная кислота) .
Н((A) =0,12, Rg($) =0,66, Rf(B) =0,88, R((Г).=0, 62. 35
П р и м е. р 3. rl--Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбоннлипролилглицилфенилаланилбензилсерилпролнна(7).
Из (4) аналогично синтезу соединения (3), используя пентафторфе- 4() ниловый эФир трет-бутоксикарбонилглицина, получают смесь, состоящую, 1 из и -нитробензилового эфира третбутоксикарбоннлглицилфеннлаланилбензилсерилпролина (.5)., Rg-(A) = 0,71, 45
Ry(S) = 0,76, Rg(В) = 0,95, Н (Г)
0,80, и пентафторфенола, которую обрабатывают трифторуксусной кислотой в условиях, описанных для соединения (2) с образованием масла, содержащего трифторацетат и -ннтробензилового эфира глицнлфенилаланилбен- зилсерилпролина (6) (Е <,Д.=0,58) 1 N уксусная кислота, Ry(A) = 0,02, R (B) = 0,67, Н 1(Г) = 0,62. Это масло нейтрализуют и используют для реакци l с пентафторфениловым эфиром третбутоксикарбонилпропилена аналогично получению соединения (3), Полученное масло очищают хроматографически (700 r силикагеля, элюируют 60 сначала хлороформом, затем смесью: хроматографическая система,>4 - изопропанол (4:1)) . После упаривания злюата получают светло-коричневое масло, которое закристаллизовывают 65 растиранием смесью эфира с гексаиом (1г1). Выход 62%. (ot,)> -43,0ь(c .1 диметилформамид), Rf(A)=0,58, Н4(Б)
О, 72, Rf(В) =0,94, Rf(Г) =Op 78.
Пример 4.. Трифторацетат Пнитробензилового эфира пролилглицилфенилаланилбензилпролина (8).
Получают из (7) аналогично синтезу соединения (4). Выход 2,47 r (98%). (Ы.) "=-27,8ь(c 1, диметилфор-. мамид), Е„; =0,57 (1 N уксусная кис-. лота); R< (A) =О, R (Б) =О, 13, Ry (В)
=0,81, R (Г).=0,26.
Пример 5. Трет-бутоксикарбонилнитроаргинилпролин (9) .
20 r (53,6 ммоль ) трет-бутоксикарбонилнитроаргинина суспендируют в
300 мл безводного этилацетата и при охлаждении (О С) добавляют 10,3 г (56 ммоль) пентафторфенола и 11,6 г (56 ммоль) дициклогексилкарбодиимида.
Перемешивают.10 ч при О С, фильтруют и при ОьC фильтрат экстрагируют
10%-ными растворами бикарбоиата калия и водой (по 100 мл), затем сушат безводным сульфатом магния, отфильтровыва:>т и упаривают. Полученное масло, содержащее пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилнитроаргинина, растворяют в 300 мл днметилформамида, добавляют 9,25 г (80 ммоль) пролина, N-метилморфолин до рН 8 н по каплям воду — до растворения пролина. Выдерживают 2 ч при комнатной: температуре, упаривают, остаток растворяют в 100 мл хлороформа, полученный раствор промывают 50 мл 10%-ного раствора бисульфата калия,,50 мл воды, а затем—
100 мл насыщенного раствора бикарбоната калия. Бикарбонатный экстракт промывают 5Qмл эфира и нейтрализуют избытком бисульфата калия до рН 2. Полученную смесь экстагируют 100 мл хлороформа, экстракт промывают 50 мл воды, сушат безвод>ным сульфатом магния. Фильтруют, упаривают, полученное масло закристаллизовывают растиранием со смесью этилацетат-гексан (1:1). Выход 10,3 г (46,1%). (сС)> — — -28,0 (с 1, диметилформамнд) . Rg(A) =0,14, Н4(Б) 0,50, Rg(B) =0,78, Н (Г) =0,67, Й (Д) =Оу84.
Пример 6. Трифторацетат. иит" роаргинилпролина (10) .
10, О г (24,0 ммоль) (9) растворяют в 50 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают при 20ьС, остаток растирают со. 100 мл безводного эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и выдерживают над гидроокисью кааия при
1 мм рт.ст ° Выход 99%. (е() -24,4
Ь (с 1, диметилформамид), Е„;, =0,65 (1 N уксусная кислота). Rg(А) =0,08, Н1(Б) =0,20 Rg (B) =0 22, Н1 (Д) =О, 40 °
892871
Tt р и м е эр 7. Трет-бутоксикарбонилнитроаргинилнитроаргинилпролин (11).
2,0 г (5,67 ммоль) (10) и масло, содержащее 5,8 ммоль центафторфенилового эфира трет-бутоксикарбоиилнитроаргииина (см. синтез соединения (9)), растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляют й-метилморфолин до рН 8. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем упари- 10 вают, остаток растворяют в 50 мл хлористого метилена и экстрагируют
50 мл 10%-ного Водного раствора бисульфата калия. Органический слой отделяют, упаривают и остаток очи- 15 щают хроматографически (200сг силикагеля, элюент - сначала этилацетат, затем хроматографическая система Б). Фракцию элюата упаривают, остаток растирают с эфиром. Выход
О 75 г (21,4%).
Пример 8 П -Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонилнитроаргинилнитроаргинилпролнлпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (12)
0,7 г (11) {1,13 ммоль) и 0,86 r
{1,13 ммоль) Комплекса F встряхивают с 50 мл хлористого метилена до растворения. ЗатеМ добавляют
l,1 г (1,30 ммоль) (8) и триэтиламин до рН 9. Выдерживают 42 ч при ком- З0 натной температуре. Затем добавляют
0,1 мл уксусного ангидрида, выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Упаривают, остаток обрабатывают смесью 20 мл воды и 20 мл этилаце- 35 тата. Образовавшийся кристаллический осадок отфильтровывают и на фильтре промывают 5 мл этилацетата. Выход
0 6 г (40,0%). ((eL)> --49,0с (с 1, . диметилформамид) . R((Б) =О, 57, Ry(В) = 40
=О, 73, Ry (Г) =О, 42.
Пример 9. Трифторацетат h— нитробензилового эфира нитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (13).
Получают из (12) аналогично синтезу соединения (10). Выход 93%. (оС) = -34,2 (с l диметилформамид), 3»
Е„;э-" 0,45 (1 N уксусная кислота),, Ву (Б) =Ор21, Rg (В) =0,54, Rg (Г) =0,43.
Пример 10. Трет-бутоксикарбонилфенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролии И -нитробензиловый эФир (14).
О 5 r (0 37 ммоль) (13) и 0,4 r (l,дЗ ммоль) и -нитрофенилового эфира трет-бутоксикарбонилфенилаланина растворяют в смеси 5 мл диметилформамида и 50 мл хлористого метилена, затем добавляют триэтиламин до рН 8.
Выдерживают 29 ч при комнатной температуре, затем упаривают, остаток обрабатывают смесью 20,мл 1%-ного водного бисульфата калия и 20 мл эфира. Образовавшуюся смолу расти- 65 рают с безводным эфиром, затем перемешивают с 20 мл безводного эфира на магнитной мешалке. Отфильтровывают, осадок высушивают,. затем перемешивают с 20 мл воды. Декантируют, высушивают в эксикаторе над пятиокисью фосфора. Выход 0,.42 г (77%). (at)g= -45,8 0 (с 1, диметилформамид), Rg(8) =О, 35, Rg (В) =0,60, В (Г) =О, 52.
П р и м е, р ll. Трет- бутоксикарбонилфенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролин (15).
О;3 г (0,203 ммоль) (14) растворяют в смеси 10 мл метанола и 2 мл воды, затем добавляют 24 мг гидроокиси натрия. Выдерживают 7 дней при комнатной температуре, упарнвают, остаток растирают с безводным эфиром, декантируют. Полученный порошок перемешивают с 10 мл воды, к которой добавляют 0,1 мл насыщенного раствора бисульфата Raëèÿ. Фильтруют, осадок иа фильтре промывают водой, сушат в зксикаторе над пятиокисью фосфора. Выход 0,20 г(73,5%) ° ()Dt 49 0o (c 1 ° диметилформамид).
Rf(A)=0,06, Rg(Б) 0,30, Rg(В) 0,54, К (Г) -0,47. Пример 12. Пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилфенилаланилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина(16).
170 мг (0,127 ммоль) (15) и 150 мг (0,198) комплекса Р растворяют в
15 мл безводного хлористого метилена. Выдерживают 20 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, фильтруют, осадок на фильтре промывают эфиром. Выход 176 мг (91%), В1(Б) =
0,60.
Пример 13. Гидрохлорид пентафторфенилового эфира фенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (17).
160 мг (0,105 ммоль) (16) растворяют в 2 мл хлористого метилена, затем добавляют,0,5 мл насыщенного раствора хлористого водорода в диоксане. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, Филь,труют. Выход 141 мг (92%), Ry(Б) =0,30
Пример 14. Цикло-(фенилаланилнитроаргинилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбенэилсерилпролил) (18).
135 мг (0,092 ммоль) (l7) растворяют в 2 мл диметилформамида и полученный.раствор добавляют к 500 мл диоксана (кипятят над натрием и перегоняют непосредственно перед употреблением). Затем вводят 0,1 мл диизопропилэтиламина, смесь энергично перемешивают и выдерживают в атмос892871
8 фере- аргона при комнатной температуре. Упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, декантируют, высушивают, затем перемешивают с 10 мл воды, снова декантируют и высушивают.
Полученное вещество очищают на 150 мг 5
:силикагеля, элюент - хроматографи- ,ческая система A - изопропанол (4:1).
Фракцию элюата, содержащую чистый циклопептид, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром н деканти- 10 руют, полученный порошок суспендируют в 5 мл воды и снова декантируют. Осадок высушивают в вакуумном эксикаторе над пятиокисью Фосфора.
Выход 24,8 мг (21,1Ъ), (Ы) =-61,8 15 (с 1, метанол) . R (Á) =0,48, В (Г) = — О, 45.
Пример 15. Цикло-брадикинин диацетат.
23 мг (0,019 ммоль) (18) гидрируют при атмосферном давлении в присутствии палладиевой черни в растворе метанола (3 мл) и уксусной кислоты (0,1 мл) в течение 70 ч, три раза меняя катализатор Отфильтро- 25 вывают, упаривают, лиофилизируют из воды. Получают пушистый порошок. Выход 15,5 мг (71Ъ) . Ен;э 0,69 (1 N уксусная кислота) . Ry (Г) =0, 28.
Биологическая активность цикло. брадикинина (ЦБ) изучена в опытах
in vivo (определено влияние на кро- вяное давление наркотизированных крыс) и in vitro (определено влияние на сократительную способность матки крыс). В качастве стандартного со- 35 единения использован синтетический препарат брадикинина производства фирмы Реанол (БК).
Проведены следующие исследования:
1. Определение влияния на кровя- 4() ное давление крыс.
Эксперименты проведены на крысах обоих полов массой 200-220 r. Животные наркотизированы 25Ъ уретаном 0.,5 мл/100 г. Кровяное давление 45 из сонной артерии, регистрировалось с помощью ртутного манометра на закопченой ленте кимографа. ЦБ и БК вводились в виде инъекциЯ в бедрен" ную вену объемом 0,1 мл/200 r в дозах 0,5-500 мкг/кг.
2. Определение миотропного действия, В экспериментах использованы крысы-самки весом 200-220 г. Регистрированы изотонические сокрашения изолированных маток крыс в определенном режиме. температуры (32oC).и аэрации. Использован метод кумулятивных сокращений (11 . Проверены коь центрации ЦБ и БК в диапазоне 1010 моль/л. Регистрация проведена на модифицированном приборе ВИ 65МА (2, 3) .
Результаты исследования.
B опытах in vivo на наркотизированных уретаном крысах установлено, что пороговая концентрация БК—
0,5 мкг/кг, ЦБ — 250 мкг/кг. В до» зе 0,5 мг/кг ЦБ вызывает эффект понижения артериального давления на
40 мм рт.ст. продолжительностью более 2 ч и при этом тенденция восстановления исходного уровня кровяного. давления не наблюдалась (см.
Фиг.1 ), в то время как длительность эффекта природного брадикинина лишь 30 с.
В опытах in vitro на изолированной матке крыс установлено, что ЦБ обладает слабой миотропной активностью, не вызывая полной ответной реакции органа даже при высоких концентрациях (ю(= 0,5220,031 ppg
=7,86+0,12; см. Фиг. 2) . Миотропная ответная реакция циклобрадикинина составляет лишь 50Ъ от эффекта Ьрадикинина, что свидетельствует об избирательности биологического действия. На фиг, 3 представлена схема синтеза циклобрадикина.
Таким образом, ЦБ по сравнению с природным брадикинином обладает черезвычайно пролонгированным депрес,сорным эффектом. Миотропный эффект
ЦБ значительно слабее эффекта брадякинина.
Сравнение биологических свойств циклобрадикинина и известного ранее циклического аналога брадикинииа (4) показывает, что первый вызывает более выраженное и устойчивое понижение кровяного давления. Так, если после применения известного циклического аналога брадикийина кровяное давление начинает частично восстанавливаться уже через 5-10 мин, то при введении нового аналога циклобрадикинина кровйное давление понижается и держится на одном уровне в течение нескольких часов. Такой эффект нельзя получить увеличением концентрации известного аналога, так как вследствие черезмерного понижения кровяного давления животные погибают.
892871
Е. !е Ю-< С, мола/л
<1 - а
HCl соотг ооон оон иг -
ВН1!ИПИ 3 акаэ 8226/5 Тираж 418 Годин оное
Филиал ППП "11агент", г.ужгород,ул.Проектная,4
Рйе Ац} Лгу Рто Рго Сly Fhe Set Pro
