Способ диагностики протейной инфекции

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗЬБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Соцнапнстнческнк

Респубики (в 908323 (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву(22)Заявлено 27 ° 05.80 (2l) 2967232/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 28.02.82 ° Бюллетень ¹ 8

Дата опубликования описания 28.02.82 (51)М. Кл.

А 61 В. 10/ОО

ВисудаувтВКИИЫй КВНИтвт

СССР аа авлзн изебРвтвиий в еткрытий (53) УДК 616-0 У (088. 8) ъ пенько, 1 (72) Авторы изобретения

С.И.Бидненко, Д.E.Äûõîâè÷íàÿ и Л.В

Киевский научно-исследовательский институт. эпидемиологии, микробиологии и паразитИмнч4ц (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике заболеваний протейной этиологии, Известен способ диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции между специфическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом результатов реакции (1).

Однако известный способ недостаточно чувствителен из-эа характера антигенного материала, непригодного для комплексной серодиагностики и обладающего ограниченным антигенным спектром, что снижает эффективность диагностики протейной инфекции.

Цель изобретения — повышение чув" ствительности способа.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции между специ" фическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом реэультатов реакции, в качестве антигена используют поливалентный препарат, содержащий О- и Н-антигенные компоненты штаммов 03:Н1, 06:Н3, 026:Н2, 030:Н4, и при выявлении титров crieцифических антител в PCK 1:10 и выше, а в РПГА 1:80 и выше диагносцируют протейную инфекцию.

Способ осуществляется следующим

1О образом.

У больного на ?-4 день и на 710 день от начала заболевания забирают кровь и готовят сыворотку, как обычно, которую исследуют в реакции

15 связывания комплемента (PCK) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), О качестве антигенного материала в

PCK применяют раствор поливалентного препарата из расчета 1 мг лиофи20 лизированного антигена на 3 мл физиологического раствора. Для поста- новки РПГА готовят диагностикум из свежих или формалинизированных эритроцитов барана,. таниэироаа ных и сен3 90832 сибилизированных поливалентным антигеном из расчета 0,04-0,05 мг антигена на 1 мл 1,5-2,03 взвеси эритроцитов в фосфатном растворе рН 6,4.

Поливалентный препарат готовят в условиях производства или лаборатории следующим образом, В качестве сырья для приготовления антигенного препарата используют высоко подвижные культуры Proteus mirabilis, принад- 10 лежащие к серотипам 03:Н 1, 06 Н3

030:Н4 и 026:Н2. При подобном подборе, штаммов продуцентов, включенные в препарат Н-антигены, позволяют ре:гистрировать H-антитела к 42 сероти" пам протеев (23 различным серогруппам) из 52 серотипов, вообще выделяемых при заболеваниях у людей, что составляет 81,03. В то же время включенные в препарат О-антигенных компо- )0 нентов наиболее важных этилогически

О-серогрупп гарантирует регистрацию иммунного ответа в случае инфицирования неподвижными вариантами протеев.

Бактериальную массу каждого из 4-х штаммов выращивают на свежеприготовленном 14-ом мясопептонном агаре при 22 С в течение 72 ч, что обеспечивает максимальное развитие жгутиковых антигенов. Массу смывают с питательной среды, промывают физ1 ологическим раствором, центрифугируя при

5-6 тыс. об/мин в течение 30 мин. Готовят взвесь клеток в дистиллированной воде из расчета 50 мг влажной массы в 1 мл. Взвесь подвергают ульт- о развуковой обработке при 12- 15 С в аппарате при частоте 800-1000 кГц, мощности 5-10 Вт в течение 10-20 мин.

Щадящая обработка ультразвуком позволяет одновременно извлекать в жидкую фазу минимально травмированные О- и Н-антигенные компоненты и обеспечивает необходимое и примерно равное их количество в препарате.

Озвученную взвесь центрифугируют при 7-9 тыс. об/мин в течение 30 мин для удаления неразрушенных клеток и о их обломков при 4 С. Полученные из

4-х штаммов экстракты соединяют в рав

50 ных объемах, перемешивают и лиофилизи. руют в сублимационной установке при о подогреве препарата до 38 С в течение 48 ч. Учет результатов PCK и РПГА .производят через 1 ч после окончания

55 реакции. Уровень антител в сыворотке в РСК- 1: 10 и выше, а в РПГА - 1:80 и .выше указывает на наличие у больного протейной инфекции.

3 4

Пример. Исследуют сыворотку крови больного Н. с клиническим диагнозом хронический пиелонефрит (из мочи выделяют культуры Proteus mirabilis u Escherichia coli) и больного И, с диагнозом гастроэнтерит невыясненной этиологии, взятые на 1-й и 9-1 день заболевания. Все 3 cbraoротки инактивировали 1 ч при 60 С на водяной бане в разведении 1:5 стерильным физиологическим раствором и исследовали в РСК и РПГЯ с поливалентным протейным антигеном. Для PCK ° готовят разведения каждой сыворотки 1:5,,1: 10, 1:20, 1:40 и i:80 в физиологическом растворе в объеме 0,2 мл.

:В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл антигена в рабочем разведении (1 мг и 3 мл физиологического раствора) и по 0,2 мл раствора комлемента в рабочей дозе, После тщательного перемешивания и экспозиции в термостате 1 ч о при 37 С в каждую пробирку добавляют по 0,4 мл гемолитической смеси (выдержанной 30 мин при 3 С смеси равных объемов 33 взвеси бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки в рабочем титре), помещают на 30 мин в термостат при 37 С. Реакцию сопроо вождают контролями сыворотки больного, антигена и комплемента. За положительную реакцию принимают задержку гемолизана 3-4 креста. Учет реакции производят через 1 ч после окончания экспозиции. Для РПГА сыворотку адсорбируют эритроцитарной массой (2 объема сыворотки к 1 объему эритроцитов) при комнатной температуре в течение

15 мин. Затем готовят ряд разведений сыворотки (по 0,4 мл) в пробирках или пластинках с лунками 1:40, 1:80, 1: 160, 1:320 и более 1i-ым раствором нормальной сыворотки кролика в физиологическом растворе. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1,5-23-ой взвеси танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигенными препаратами (сенсибилизирующая доза

0,04-0,05 мг/мл), перемешивают и оставляют при комнатной температуре.

Реакцию сопровождают контролями: сыворотки больного (с несенсибилизированными эритроцитами) и диагностикума (с нормальной кроличьей сывороткой).3а положительную реакцию принимают наличие гемагглютинации "зонтик" на 3-4 креста. Для получения поливалентного антигенного препарата 5 г бактериальной массы каждого

5 9083 из 4-х выращенных на свежеприготов" ленном 14-ом МПА в течение 72 ч при о

22 С промывают один раз 60 мл физиологического раствора, центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин.

Готовят 100 мл взвеси отмытых клеток в дистиллированной воде из расчета 50 мл влажной массы на 1 мл, смесь подвергают ультразвуковой обработке при частоте 44 кГц в тече- Ю ние 3-5 мин. Озвученную взвесь центрифугируют при 8000 об/мин в течение

30 мин. Полученную надосадочную жидкость, опалесцирующую, свободную по данным бактериологического и микро- и скопического контролей от неразрушенных клеток, соединяют с равными.объемами приготовленных таким же способом экстрактов 3-х других штаммов.

Объединенный экстракт разливают в 2О стерильные флаконы и лиофилизируют на сублимационный установке при подогреве препарата до 38 С в течение 48 ч.

Получшеет 850 мг препарата, что составляет 21,53 от веса сухой биомассы.г5

Препарат содержит 55,04 белка, 12,24 сахаров, 13,53 влаги и 12,04 зольных элементов. Антигенный спектр препарата определяют в РСК и РПГА с адсорбированными агглютинирующими О- и Н- зв антисыворотками Московского НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Иечникова.

Положительные реакции с соответствующими О-сыворотками в PCK в титрах

1: 34-1:64, а в РПГА - 1: 16-1: 32 и с

Н-сыворотками, соответственно, 1: 321:64 и 1:64- 1:256 указывают на лрисутствие в препарате Н- и О-антиген- ° ных компонентов каждого исходного штамма примерно в равных количествах или с превалировайием Н-антигена. Ис.пытания серологической активности препарата показали, что рабочая доза поливалентного препарата в РСК и РПГА (с танизированными эритроцитами)сос- 45 тавляет 0,25-0,30 мг/мл и 0,040,05 мг/мл соответственно. При этом в иммунных кроличьих сыворотках в РСК выявляют титры антител 1:320- 1:640, в РПГА t:20480- 1:40960. Полученный лиофилизированный препарат сохраняет антигенную активность при 4 С на протяжении 2-х и более лет (срок наблюдения).Учет результатов выявления специфических протейных антител в исследо55 ванных 3-х сыворотках показал следующее

1) Сыворотка больного Н. РСК положительна в титре 1:Щ, РПГА положительна в титре 1:80

23 6

2) Сыворотка больного M. PCK отрицательна.в титре 1:5 (на 1-й день заболевания) РПГА положительна в титре 1:20

3) Сыворотка больного И. PCK положительна в титре 1:5 (на 8-й день заболевания) РПГЯ положительна в тит" ре l:80

У больного Н. выявлены специфические антитела в РСК в титре, превышающим диагностический (1:10), и в РПГА в титре диагностическом, следовательно, в данном случае имеет место хронический пиелонефрит протейной этиологии и показано применение соответствующей иммуно- и антибиотикотерапии. У больного M. при отсутствии бактериологического подтверждения, а значит при невозможности установления этиологического диагноза известным способом в реакции агглютиыации с аутоштаммом в сыворотке, взятой на 8- 1 день заболевания, выявлены противопротейные антитела в PCK титре 1:5 (ниже диагностического)и в РПГА - 1: 160 (диагностической титр) .

Учитывая результаты и факт нарастания титра антител в РПГА в 4 раза по сравнению с 1-м днем заболевания, в данном случае также ставят диагноз острого гастроэнтерита протейной этиологии.

Предлагаемый способ применен при диагностике йротейной инфекции 97 сы" вороток детей с острыми кишечными заболеваниями различной этиологии.

Параллельно сыворотки 12 детей, выделявших протей, испытывали в реакции агглютинации с аутоштаммами. Оказалось, что у детей, не выделявших Proteus mirabilis, РСК была отрицательной, а РПГА — положительной в титрах 1:10- 1:20, т.е. ниже диагностического значения, у 5 детей из 78, что составило 6,24. 8 то же время из детей выделявших протей двухили трехкратно (1 человек) предлагаемым способом удалось поставить диагноз протейной инфекции у 8. детей (диагностический титр в PCK 1:10

1:20 у 3 и в РПГА 1:80-1:60 - у 7), в то же время с помощью реакции агглютинации с аутоштаммом удалось поставить диагноз протейной инфекции лишь у 3 детей из 11, повторно выделявших протей (диагностические титры антител 1:80-1: 160) . Таким образом предлагаемый способ обладает большей чувствительностью по сравСпособ диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции междУ специфическим

Составитель Ю.Алмазов

Техред И.Тепер Корректор-Г.Назарова

Редактор И.Тыкей

«««» «»«««

Заказ 676/4 Тираж 717 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д 4/5

«y »«

«« филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4

7 908323 8 нению с известным способом в 1,8 ра" антигеном и исследуемой сывороткой с за для урологических и в 2,4 раза последующим учетом результатов реакдля кишечных заболеваний, специфичен, ции, отличающийся тем, упрощает этиологическую диагностику что, с целью повышения чувствительпротейной инфекции, делает диагностику s !ности способа, в качестве антигена возможной независимо от периодичности используют поливалентный препарат, выделения возбудителя и культурально- содержащий 0- и Н-антигенные компоантигенных свойств выделенных штам- ненты штаммов 03:H1, 06:Н3, 026 :H2, мов и дает более достоверные реэуль" 020:Н4, и при выявлении титров спе таты благодаря возможности одноврв" о цифических антител в PCK 1:10 и выше, менного применения двух серологичес- а в РПГА 1:80 и выше диагносцируют ких тестов.

/ протейную инфекцию.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Формула изобретения 1. Витвицкий В.И.Значение бактериологических и серологических исследований при протейных инфекциях.

"Врачебное дело", 1975,, М 3, c° . 139144,