Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической про-: мышленности и может быть использо- вано при производстве ферментных пре- паратов глюкоамилазы на основе глу" бинного способа культивирования.

Известны способы получения .фермен " тов., позволяющие интенсифицировать процесс культивирования продуцентов .. путем дробной подачи питательных веществ.

При .получении цефалоспорина куль-, турой Streptomyces clavuligerus уста- новлено что аммонийный азот усиливаI : 15 ет рост микроорганизма, но ингибирует антибиотикообразование (1).

Ийгибирующее действие солей аммо" ния на образование антибиотика ска" зывается лишь при добавлении их к; средам в начале ферментации или че-.

20 рез 24 ч, а более позднее добавление не сказывается на продуцирующую способность микроорганизма, T..е, со" ли аммония не связаны неоосредствен но с механизмом биосинтеза.

Известен способ получения глюкоамилазы при глубинном культивирова" нии продуцентов из рода Aspergi Eius на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и стимуляторы биосинтеза. ферментов, где предусматривается добавление в процессе роста продуцента аммонийного азота в виде газообразного или водного раствора аммиака, количество которого регулируется поддержанием величины рН культуральной жидкости в пределах 5,5 + 0,2. При этом конечная активность в культуральной жидкости повышается на 80т по сравнению с подачей аммонийного азота в виде (МН4) НРО4, в количестве

1„0> непосредственно в питательную среду перед началом культивирования 2 g. Недостатки известного способа заключаются в том, что основное воздей3 91275 ствие аммониййого азота на культуру осуществляется только в стадии актив-: ного роста культуры не учитываются оптимальные концентрации азота на разных стадиях роста и развития продуцента1 не обеспечивается оптималь" ное соотношение углерода и азота в начальном периоде образования биомассы не создаются условия для мак" симального накопления глюкоамилазы в 10 конце культивирования.

Цель изобретения - увеличение выхода и активности глюкоамилаэы и сок" ращение срока культивирования продуцента. 1$

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкоамилазы, предусматривающему глубинное культивирование продуцентов из, рода Aspergi Plus на питательной сре- О де, содержащей источник углерода, источник аммонийного азота, минеральные соли и стимуляторы биосинтеза ферментов, в процессе культивирования концентрацию аммонийного азота в сре-. ,де изменяют постадийно: источник аммонийного азота вводят в количестве

0,1-0,4 г/л на стадии экспоненциального роста культуры до начала активного синтеза глюкоамилазы, в период

30 активного синтеза фермента концентрацию аммонийного азота увеличивает до 0,25-1,0 г/л, а по окончании синтеза фермента до начала автолиза культуры снижают до 0,05-0,5 г/л пу" тем разбавления культуральнои жидкос35 ти стерильной водой.

В качестве источника аммонийного азота используют двузамещенный фосфорнокислый аммоний или трехэамещен о ныи фосфорнокислыи аммоний, или гидро" окись аммония, или аммониевые соли молочной или лимонной кислот, или аммонийные поликарбоновые кислоты,которые вводят в культуральную жидкость в виде стерильных растворов.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят питательную среду, содержащую,4: кукурузная мука 7, кукурузный крахмал 5, БВК 2,0 и (ИН ) НР04

0,05-0,2. После стерилизации и охлаждения среду, в которой содержится

0„1-0,4 г/л аммонийного азота, засевают посевным материалом грибов из рода Asperg 3Pus. После 24 ч культи вирования в культуральную жидкость вводят источники аммонийного азота в виде стерильного раствора в количест"

3 4 вах, обеспечивающих концентрацию аммонийного азота на стадии активного биосинтеэа, в пределах 0,251,0 г/л. После 60-90 ч культивирования к культуральной жидкости добавляют 20"30ь стерильной воды, снижая таким образом концентрацию аммонийного азота в среде до 0,05-0,5 г/л. Культивирование продолжают до максимального накопления глюкоамилазной ак"... тивности (72-110 ч роста).

Пример 1 (контроль). В биолафит емкостью 50 л загружают при ко-, эффициенте заполнения 0,5 питательную среду с оптимальными соотношением компонентов,3: мука кукурузная 7, крахмал кукурузный 5, EBK 2,0, (NH< ) HPO1, 0,1. После стерилизации и охлаждения среды, в которой содержится 0,2 г/л аммонййного азота,производят засев посевным материалом гриба AsperglEEus niger Т-33. Культивирование продуцента глюкоамилазы осуществляют в течение 140 ч с подачей раствора аммиака (NH40H) до поддер- " жания рН в процессе культивирования на уровне 5,5 4» 0,2. Активность глюкоамилаэы в конце культивирования со-, ставляет 80 ед/ил.

Пример 2. Подготовку и эа-j сев питательной среды осуществляют как в примере 1, но начальная кон" центрация аммонийного азота в среде составляет О, 1 г/л за счет добавления 0,54 (NHQ)3P04. В качестве продуцента используют посевной материал

Asperg i EPus аиааог -122.

После 24 ч культивирования в культуральную жидкость вводят стерильный раствор C4Hg0HNH4 в количестве, поддерживающем концентрацию аммонийного азота в пределах 0,25 г/л до 60 ч роста, затем в культуральную жидкость добавляют 203 стерильной воды до содержания аммонийного азота 0,05 г/л и культивирование продолжают до 72 ч роста. Конечная активность в культуральнай жидкости

126 ед/мл.

Пример 3. Подготовку и засев питательной среды проводят аналогично примеру 2 за исключением начальной концентрации аммонийного азота в среде, которая составляет

0,4 г/л за счет добавления 0,23 (NHg)gHPO4.

После 24 ч культивирования, когда концентрация аммонийного азота снижается до 0,2 r/ë, в культуральную жидФормула изобретения

Составитель Е.Воробьева

Редактор Л. Веселовская Техред E. баритончик Корректор С.Шекмар

Заказ 1316/35 Тираж 505 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий

113035, москва, Ж-35, Раущская Ha6., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 9127 кость добавляют стерильный раствор

СЬН407ИН4 в количестве, обеспечивающем содержание аммонийного азота

0,6 г/л. После 60 ч культивирования в культуральную жидкость добавляют

304 стерильной воды и культивирование продолжают до 90 ч роста. Конечная активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет 138 ед/мл.

Таким образом, предложенный спо- N соб получения глюкоамилазы позволяет сократить срок выращивания продуцентов глюкоамилазы на 30-69 ч за счет ускорения роста биомассы в начале процесса, повысить глюкоамилазную ак- 15 тивность в культуральной жидкости на 17-58 ед/мл.и, соответственно, ;выход целевого продукта на 8-29усл.кг за .счет интенсификации накопления глюкоамилазы в период активного био- 2о синтеза,. снизить удельный расход компонентов питательной среды в .1,2- 1, 3 раза за счет увеличения продуктивности процесса.

Ожидаемый экономический эффект 25 составляет 418,55 тыс. руб.

Способ получения глюкоамилазы путем глубинного культивирования продуцентов из рода Asperji Eius на питательной среде, содержащей источник углерода, .источник аммонийного азота, минеральные соли и.стимуляторы биосин53 б теза ферментов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения выхода и активности глюкоамилазы и ,сокращения рока культивирования про" дуцента, в процессе культивирования концентрацию аммонийного азота в сре4 де изменяют постадийно: источник аммонийного азота вводят в количестве 0,1-0,4 г/л на стадии экспоненциального роста культуры до начала . активного синтеза глюкоамилазы, в период активного синтеза фермента концентрацию аммонийного азота увеличивают до 0,25-1 г/л, а по окончании синтеза фермента до начала автолиза культуры снижают до 0,05-0,5 г/л путем разбавления культуральной жид" кости стерильной водой.

2. Способ по и. 1, о т л и ч à юшийся тем, что в качестве источ" ника аммонийного азота используют двузамещенный фосфорнокислый аммоний или трехзамещенный фосфорнокислый аммоний, или гидроокись аммония, или аммониевые соли молочной или лимонной кислот, или аммонийные поликарбоновые кислоты, при этом в культуральную жидкость их вносят в виде стерильных растворов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Canadian .Gourna 8 of 8icrobio1ogy, 1979, 25, t 1, 61-67.

2. Патент США и 3660236, кл, С 12 0 13/10, опублик. 1972 {прототип),

Патент 402541 // 402541

Питательная среда для выращивания продуцентов глюкоамилазы // 361199

Патент 345815 // 345815

Всесоюзная j // 340690

Патент 259031 // 259031

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы // 2181770

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности с целью получения глюкозы в процессе гидролиза крахмала

Штамм мицелиального гриба aspergillus awamori - продуцент глюкоамилазы // 2196821

Изобретение относится к биотехнологии, может применяться для осахаривания крахмалистого сырья в различных отраслях пищевой промышленности, где требуются высокоактивные ферментные препараты, устойчивые к кислым значениям рН

Способ подготовки полисахаридного сырья к микробиологической конверсии // 2202606

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве ферментов, белка, этилового спирта, кормов и др

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы // 2204600

Штамм мицелиального гриба aspergillus awamori - продуцент глюкоамилазы // 2245364

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для осахаривания крахмалистого сырья в различных отраслях пищевой промышленности, где требуются высокоактивные ферментные препараты, устойчивые к кислым значениям рН

Ферментативно гидролизованные пшеничные отруби с глюкоамилазной, протеолитической и ксиланазной активностями, и способ их получения путем твердофазного сбраживания пшеничных отрубей с помощью aspergillus niger // 2246536

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для производства этилового спирта или корма моногастральных животных

Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы // 2366712

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: -амилазы и глюкоамилазы, которые используются в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной промышленности, медицине, т.е

Глюкоамилаза trichoderma reesei и ее гомологи // 2394101

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой молекулу ДНК, кодирующую фермент, обладающий активностью глюкоамилазы, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с глюкоамилазой из Trichoderma, обладающей последовательностью SEQ ID NO: 4

Варианты глюкоамилазы // 2439153

Изобретение относится к биотехнологии, к вариантам глюкоамилазы с измененными свойствами и к способам применения вариантов глюкоамилазы

Рекомбинантный штамм мицелиального гриба aspergillus awamori - продуцент комплекса ферментов глюкоамилазы и ксиланазы // 2457246

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности для получения комплексных препаратов глюкоамилазы и ксиланазы с целью дальнейшего их применения для гидролиза крахмалосодержащего сырья в различных отраслях пищевой и перерабатывающей промышленности (спиртовой, хлебопекарной, пивоваренной, кондитерской промышленности, при производстве диетического питания, пищевых добавок, кормов для животных)