Способ иммобилизации клеток микроорганизмов с @ - тирозиназной активностью

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗО6РЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советсиин

Социалистичесиик

Рвслублии ь (ii) 922142 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (5l)M. Кл. (22) Заявлено 30.06.80 (21) 2948047/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет

Опубликовано 23.04.82. Бюллетень № 15

Дата опубликования описания 25.04.82

С 12М 11/04 фвударетеенньй кемнтет

CCCP ао делзе(нзебретеннй н вткрытнй (53) УДК 577. .15 (088.8) (72) Авторы изобретения

И. В. Тысячная, В. И. Яковлева, И. В. Ъер зин.,:" ь;А,-.,К.,;Аре

Ю«;I

4 .. » - (-,.;.(7I ) Заявители

Б

" " з

«йЬ 4» с5 (54) СПОСОБ .ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

С ф -ТИРОЗИНА ЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к органическо химии, а именно к способам получения иммобилизованных клеток микроорганизмов с Ъ --TmpoaHHasHoR (КФ 4.1.99.2) активностью.

Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов для получения различных веществ в последнее время очень расширяется. Иммобилизации клеток позволяет более эффективно использовать каталитические свойства микроорганизмов, так как исключаются затраты на выделение .и очистку ферментов. Иммобилизованные клетки с у -тирозиназной активностью могут быть использованы для ферментного синтеза,l„--тироэина, аминокислоты, получение которой другими способами является сложным и дорогим.

Известен лишь один способ иммобилизации клеток микроорганизмов с -гирозинаэной активностью путем включения в гель.

По этому способу иммобилизацию кле. ток Ега1тйс} ег1р ОРс1 штамм АТСС

21434 проводят включением в гель, образуюшийся путем смешивания водорастворимых полимеров поливинилового спир5 та, желатина, карбоксиметилцеллюлозы и тетраалкоксисилана с добавлением кислоты. Гель сушат в замороженном состоянии в течение нескольких суток. Все операпии проводят при темйературе ни10 же 5 С. Удельная активность полученноrо препарата составляет

7 ° 10 с,мг белка клеток по стабильности препарата в описании изобретения отсутствуют Г13.

Недостатками способа являются недостаточно высокая ф -тирозиназная удельная активность препарата, сложность и длительность процесса иммобилизации нэ-эа осуществления всех операций при низкой температуре, применение дефипитных и дорогостояшнх полимеров, в том числе пишевого сырья.

11 » изобретения - повышение удельной активности препарата, упрощение и удешевление процесса.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации клеток микроорганизмов с 3 -тирозиназной активностью путем включения их в гель, иммобилизацию приводят в присутствии стабилизатора- ацетата аммония, ипи пирувата натрия или g -тирозина при этом в качестве геля используют поли- акриламидный гель, а из микроорганизмов испопьзуют штамм Cdtl obctctSI

fI 8VIId.. 1 62. !

Иммобилизацию клеток проводят в фосфатном буфере рН 7-8 с добавлением ацетата аммония, либо в ацетатном буфере при рН 8. В буфере смешивают суспензию клеток, растворы акриламида и метиленбисакриламида, N, М, К, Й

2D тетраметилендиамина и персульфата аммония. Реакционный сосуд погружают в баню со льдом. Попимеризация заканчивается через минуту, Блок полученного полиакриламидного геля с включенными клетками протирают через полиэтиленовое сито с размером пор 1 1 мп8. и отмывают от свободных клеток. В гель включается 89% клеток. При иммобили30 зации сохраняется 65% первоначальной активности. Удельная каталитическая активность иммобилизованных клеток со- . ставляет (в зависимости от партии)

3-0,4. 10 моль/с мг белка. Препарат хранят в буфере при рН 8 и +40 через 35 месяц хранения иммобилизованные клеткИ сохраняют 60% активности от исходной, в то время как нативные клетки за этот срок полностью теряют Q -тираэиназную активность. Иммобилизованные клетки можно неоднократно использовать для синтеза тирозина. При этом после первого использования сохраняется 95% активности, после второго — 80%, после третьего - 50%.

Примерl. К04мл001М фосфатного буфера рН 7,0 добавляют 1 мл

0j5 М ацетета аммония (доведенного концентрированным раствором аммиака до рН 8) 0,2 мл суспенэии клеток 11г0- 50 С А " " "" 1" 62, содержащей 53 мг белка с удельной Q --тирозиназной каталитичесиэй активностью, определенной стандартным методом по синтезу тирозина 4,6 10 моль/с мг белка, 1 мл 55

50 -ного раствора акриламида с добавлением метиленбисакриламида в соотношении 19:1; 0,3 мл 10%-ного раствора

42 4 !

Й» М, К, g -тетраметилэтилендиамина и 0,3 мл 10 /-ного раствора персульфата аммония, Все растворы готовят на

0,01 М фосфатном буфере рН 7,0. Смеск быстро перемешивают в чашке Петри, помещенной в лед. Полимеризация начинается через 30 с и заканчивается через

1 мин, .блок полиакриламидного геля с включенными в него клетками протирают через полиэтиленовое сито с размером пор 1IIl мм . Частицы геля отмывают от

Я свободйых клеток 0,05 М аммоний-ацетатным буфером рН 8,0. В гель включается количество клеток, соответствующее

47,7 мг белка, т.е. 90%. Удельная каталитическая активность по синтезу,4 тирозина иммобилизованных клеток равна

-8

3 10 моль/c,ìã белка, что составляет

65% от исходной. Препарат хранят в буфере при рН 8 и +4 С. Через месяц хранения активность иммобилизованных клеток составляет 60% от первоначальной.

При проведении иммобилизации без ацетата аммония, сохраняется лишь 20%

1Ъ -тирозиназной активности.

Пример 2. Способ осуществляют, согласно примеру 1, но все растворы готовят в 0,05 М аммоний-ацетатном буфере рН 8,0. Результаты аналогичны полученным в примере 1.

Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 1. Используют другую партию клеток с исходной удельной Я— тирозиназной активностью, равной

1,25 ° 10 Вмоль/с.мг белка. K смеси для полимеризации акрильных мономеров добавляют вместо t),5 М ацетата аммо- . ния 0,5 М пирувата натрия до конечной концентрации 0,2 М. Получают иммоби- . лизованные клетки СЛг8.обй1 62 с удельной активностью 0,74 10 моль/с мг белка, т.е. с сохранением 59% активности свободных клеток и 90 -ным включением клеток в полиакриламидный гель.

Пример 4. Способ осуществляют согласно прймеру 1. Используют ту же партию клеток g.& Вцьдм, что и в примере З. К смеси для.полимеризации акрильных мономеров добавляют 2,.25 мг

-тирозина и доводят фосфатным буфером до общего объема 5 мл.

Получают иммобилизованные включением в полиакриламидный гель клетки С.

ЬФ)йд11 62 с удельной ф -тирозиназной активностью, равной 0,5 ° 10" моль/c MI белка, т.е. равной 40% от первоначаль5 Ì2 ной в 93% ным включением клеток в полиакриламидный гель.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществить иммобилизацию клеток микроорганизмов с сохранением высокой удельной 9 -тироэиназной активностью. При этом повышается стабильность фермента. Достоинствами спо; соба являются также йростота и исполь1зование в качестве носителя доступного 1О ,и недорогого полиакриламидного гепя.

Формула изобретения

Способ иммобилизации клеток микроорганизмов с ф -тирозиназной актив142 6 ностью путем включения их в гель, о тл и ч а ю шийся т ы, что, с цепью, повышения уделыюй активности препарата, упрощения и удешевпения процесса, иммобилизацию проводят в присутствии стабилизатора-ацетата аммония нпи пирувата натрия или -mpoaaaa, при этом в качестве геля используют попиакриламидный гель, а из микроорганизмов испол зуют штамм С ОЬаСАег freun64 62.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США Ne 414S689, кл. 195-65, опублик. 1979.

Составитель И. Привалова

Редактор Л. Лукач Техред А. А ч Корректор Л. Бокля

Заказ 2505/34 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/S

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4