Способ определения радиоактивности вещества по восстановленному серебру авторадиограммы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАДИОАК-I ТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА ПО ВОССТАНОВЛЕННОМУ СЕРЕБРУ АВТОРАДИОГРАММЫ, включающий проявление авторадиограммы, подготовку к-элюции, элюцию исследуемого вещества, его фотометрирование, подсчет количества восстановленного серебра и определение величины радиоактивности , отличающийся тем, что, с целью повьшения точности и чувствительности при одновременном упрощении способа, при элюции получают восстановленное серебро путем обработки 0,1-0,5 Н водным раствором азотной кислоты в течение 20-30 мин., и разведения его 0,5 Н раствором серной кислоты, затем добавляют 0,15-0,25 М раствора дитизона в хлороформе , отделяют органическую фазу и после фотометрирования, подсчитывая количество восстановленного серебра, § определяют величину радиоактивности (Л вещества.

1 ..SU„„931013 А

СОКИ СОВЕТСНИХ

МВ Л М

РЕСПУБЛИК

3(!Ю G 01 Т 1/167

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

l3

ЬВР" " j

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) .2974483/18-25 (22) 08.08.80 (46) 15.09.83. Бюл, 9 34 (72) Г.В. Донченко, Р.В. Чаговец и E.Ê. Вовнянко (71) Институт биохимии им А.В. Палладина (53) 53.084.89 (088.8) (56) 1. Заявка Японии 9 48-27716, кл. III.1,опублик. 1973.

2. Ивайчев Г. Дитидон и его приМейение,. София, 1961, гл. 1.

3. J.Jowsey, Journal of Applied

Physiology т. 21; 1966, В 1,с. 309312 (прототнп) ° (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАДИОАК-1

ТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА ПО BOCCTAHOBJIEHHOИУ СЕРЕБРУ АВТОРАДИОГРАИМЫ, включающий проявление авторадиограммы, подготовку к-элюции, элюцию исследуемого вещества, его фотометрирование, подсчет количества восстановленного серебра и определение величины радиоактивности, отличающийся тем, что, с целью повьиаення точности и чувствительности при одновременном упрощении способа, при элюции получают восстановленное серебро путем обработки 0,1-0,5 Н водным раствором азотной кислоты в течение 20-30 мин., и разведения его 0,5 H раствором серной кислоты, затем добавляют

0,15-0,25 М раствора дитиэона в хлороформе, отделяют органическую фазу и после фотометрирования, подсчитывая количество восстановленного серебра, Я определяют величину радиоактивности вещества.

931013

Изобретение относится к способам исследования радиоактивности веществ методом авторадкографик, и может использоваться для количественного оп- ределения относительной радиоактивности веществ при осуществлении метода радионзотопного мечения.

Широкое применение этого метода в практике. современной физиологии, биохимик, цитологии и электронной микроскопии вызвано необходимостью в разработке и совершенствовании методов качественной и количественной оценки радиоактивности веществ.

Известны способы количественной оценки радиоактивности веществ путем измерения оптической плотности участков авторадиограмм с помощью денситометров I.13. . Существенным недостатком денситометрии является низкая точность и эффективность измерения оптической плотности участков различной геометрической формы. Кроме того, при осуществлении этого метода используется узкоспециализированная, дорогостоящая аппаратура.. Совокупность этих моментов затрудняет использование денситометрического метода для количественной оценки радиоактивности веществ.

Поэтому наиболее прогрессивным способом является количественное определение радиоактивности веществ по восстановленному серебру авторадиограмм, особенно при использовании образцов с малой радиоактивностью, — Известен метод количественного определения восстановленного серебра с помощью дитизона (2}, отличающийся высокой точностью. Способ включает следующие операции: к исследуемому раствору:сначала добавляют серную кислоту (0,1-1 н), а затем избыток раствора дитизона в четыреххлористом углероде; определяют раствор дитизона серебра, фотометрируют и определяют количество восстановленного серебра в исследуемом растворе ° Реакция восстановления серебра

2Ag,,- (водн. р-р) + Hz Dz (орган. р-р) Ag Dz (орган. р-р) + 2Н (води. р-р) где дитизон (Dz) представляет собой

CgH g — — NCSNHNH CgHj, Однако этот способ не пригоден для подсчета восстановленного серебра на подложке светочувствительного материала.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является .способ определения радиоактивности веществ по восстановленнОму серебру авторадиограмм, включающий прявление авторадиограммы подготовку к элюциК, элюцию исследуемого вещест5

t0 гирование, фотометрирование и подсчет количества синего красителя, а по нему определение соответствующего количества восстановленного серебра и затем количества радиоактивности.

Окрашивание проходит по реакции:.

CRH$,, он

44у+ P> I N мн + ан. /

СИ с, и

)ng<< и= =а

С И

СН с, +р +1Н

Описанный способ позволяет. проводить количественное определение оптической плотности и ее сравнение на участках любого размера и формы.

Однако этот способ не обеспечивает прямого определения восстановленного серебра фотоэмульсии пленок, и, следовательно, прямого определения радиоактивности веществ по восстановленному серебру. Кроме того, проникновение синего красителя в желатиновый слой .ограничено из-за недостаточной специфичности красителя и адсорбции его веществом пленки. Эти

1 особенности отрицательно влияют на точность метода (ошибка 5Ъ).

Следует также отметить сложность проведения ряда операций: многостадийное проявление авторадиограммы в темноте; приговление проявляющего раствора непосредственно перед использованием для исключЕния аэробного окисления; отдельное проявление каждого отпечатка (в течение 8 ми-, нут) и протирание его для избежания адсорбции красителя в фотослое.

Целью настоящего изобретения является повышение точности и чувствительности при одновремерйом упрощении способа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения радиоактивности веществ по восстановленному серебру авторадиограммы, который включает проявление авторадиограммы, подготовку к элюции, элюцию исследуемого вещества, его фотометрирование, подсчет количества восстановленного, серебра и определение величины радиоактивности, восстановленное серебро как эквивалент радиоактивности палу l5

25 ва, его фотометрирование, посчет количества восстановленного серебра и определение величины радиоактивности 133.

Этот способ включает проявление авторадиограммы в темноте с помощью синего красителя, получение иозитив. ного иэображения; подготовку к элюции и элюцию синего красителя путем растворения желатины фотопленки раствором трипсина, экстракцию синего ,красителя п-бутилацетатом, центрифу931013

Еvz4g е

R =

65 чают непосредственно при элюции, которую проводят .путем обработки 0,10,5 Н водным раствором .азотной кислоты в течение 20-30 мин., и разведением его 0,5 Н раствором серной кислоты, затем добавляют 0,15-0,25 М . раствор дитизона в хлороформе, отде-, ляют органическую фазу, Фотометрируют и после фотометрировани- подсчиты. вают количество восстановленного серебра, которое соответствует количеству радиоактивности.

Сущность предложенного способа поясняется примерами его осуществления.

Пример 1.

Проводят определение радиоактивно 15 сти С-убнхинона неомываемой Фракции печени крыс после введения им 1 м Си 14С-ацетата за б часов до забоя.

Разделение компонентов неомыляемой фракции печени крыс осуществляют известным методом с использованием методов тонкослойной и бумажнойхроматографии.

Полученные хроматограммы помещают в камеры, экспонируют в течение 2030 дней в темноте с наложенной рент» ген-пленкой РМ-1.

Время экспонирования подбирают предварительно в зависимости от радиоактивности раствора, который наносят на хроматографичесую пластинку или бумагу. Коэффициент контрастности участков пленки должен быть меньше 1. Полученные авторадиограммы проявляют. Потемневшие и контрольные участки одинаковой геометрической формы вырезают из авторадиограммы, взвешивают, измельчают и помещают в колбу Къельдалян, в которой содержится 5мл 0,5 и раствора азотной кислоты. ° 40

Элюцию восстановленного серебра авторадиограмм проводят при 100 С в течение 20 мин. Затем элюенты охлаждают, переносят в мерные колбы на 50-100 мл и разбавляют 0,5 H раствором серной кислоты.

Окрашивание восстановленного серебра проводят, помещая аликвоты исследуемых растворов в длительные воронки с 5 мл 0,15 M раствора дити. зона в хлороформе. После встряхивания в течение 30 сек, отделяют окрашенную органическую форму, содержащую дитизонат серебра и фотометрируют на Spekol при 620 м мк против контроля, (экстракты с конт-,. рольных участков пленки получают по аналогии с исследуемыми с соблюдением разведения кислотами и добавлением

5 мм 0,15М раствора дитизона в хлороформе) . . 60

Радиоактивность исследуемого вещества определяют по формуле: где: R

†радиоактивность (имп/мин), EDzAg - показатель экстинкции . раствора дитизона серебра, К - коэффициент молярной экстикции днтизона серебра, Й; — коэффициент пересчета

68,4,10, выведенный эмпирически по графику зависимости CAg = KR.

Радиоактивность С - убихинона соответствовала 56т4 имп/мин.

Для проверки .полученных данных про водят элюцию изучаемых веществ хроматограмм с помощью 15 мл серного эфира.

Полученные элюенты наносят на филь тры и измеряют радиоактивность на счетчике SL - 30. Ошибка определения, радиоактивности изучаемых соединениЯ предложенным методом составляет 2%, а .с применением счетчика SL - 30 — 5

Пример 2.

Аналогично проводят определение радиоактивности "4 С-убихинона неомыляемой фракции печени крыс после введения им 1 м Сц и 4С - ацетата за 6 часов до забоя..

Разделение компонентов фракции по методу тонкослойной и бумажноЯ хроматографии, экспонипование хроматограмм с рентгенпленкой, проявление авторадиограмм проводят аналогично методике, описанной .в примере 1.

Потемневшие контрольные участки одинаковой геометрической формы вырезают из авторадиограмм, взвешивают измельчают и помещают в колбу Къель» даля с 10 мл раствора 0,3 азотной кислоты. Элюцию восстановленного серебра авторадиограмм проводят при

100 С в течение 25 мин. Затем элюенты охлаждают, переносят в мерные кол. бы на 50-100 мл и разбавляют 0,5 Н раствором серной кислоты.

Окрашивание восстановленного серебра проводят, помещая аликвоты исследуемых растворов в делительные воронки с 10 мл 0,25 М раствора де-! тизона в хлороформе. После встряхивания в течение 30 сек. отделяют окрашенную органическую фазу, содержащую дитизонат серебра, фотометри.руют. на Spekol при 620 ммк против контрольных участков, радиоактивность .которых определяют анало-. гично

Радиоактивность С-убнхинона определяют по формуле I. R = 55 + 4 имп/мин.

Полученные данные проверяют путем элюции изучаемого вещества с хроматограммы с помощью 15 мл серного эфира. Радиоактивность элюентов, наносиМых на фильтре, измеряют на счет,чике SL — 30. Ошибка определения

931013

Пример Пример

8 9

Пример Пример

6 7

Пример Пример

4 5

Пример

4.С- "4Ñ- "4С-хо- 4С С-НК 4 С-HA "4C-HAg 4С- ф убихро- сквален лестерин менол

R (имп/мин) 241+5 218+5

163+7

Составитель Б. Рахманов

РедактОр Е. Дайн Техред Т.Фанта Корректор М. Дев4чик

Заказ 10871/3 Тираж 710 Подписное

ВНИИПИ Государственного .комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, радиоактивности излучаемых соединений согласно предложенной методике составляет 2%, а при использовании счетчика SL - 30 - 5%.

Пример 3.

Все операции по определению радиоактивности 14с-убихинона неомыляемой фракции печени крыс осуществляют в соответствии с последовательностью, описанной в примерах 1 и 2. Обработку участков пленки проводят в 5 мл раст- 10 вора 0,1 азотной кислоты в колбах

Къельдаля при 100 С в течение 30 мин.

После разбавления 0,5 Н раствором серной кислоты окрашивают восстановленное серебро в делительных ворон- )5 ках 0,5 мл 0,3 М раствора дитизона в хлороформе.

Радиоактивность 4Ñ-убихинона определяют по формуле:

R = .56 + 7 имп/MHH

Пример ы 4-10.

Проводят определение радиоактивности "4С-убихроменола, 14С-сквалена

14С-холестерина, <4С-НК (никотиновой кислоты), 14с-нА (никотинамида), 4С-.НЛД (никотинамидадениндинукдеотид) и +С-НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфата) аналогично определяют радиоактивности f4Ñ-убихинона.

Результаты определения радиоактивности R сведены в таблицу.

Проверяют полученные данные путем элюции изучаемых веществ с хроматограмм с помощью 5 мл серного зфира.

После нанесения элюентов на фильтры измеряли кх радиоактивность на счетчике SL - 30.

Как в примерах 1-3, ошибка определения радиоактивности изучаемых соединений предложенным методом составляла около 2Ъ| а с применением счетчика SL - 30 до 5Ф.

Таким образом использование изобретения позволяет повысить точность и чувствительность измерений по определению радиоактивности вещества.

32+8 110+12 259+23 168+10