Способ получения фосфодиэстеразы

 

А. A. Ииериня,. Э. П. Сийгур, Ю. P . Гии) ур —,А .Я, Тара, Э.Э. Аавиксаар, В. Э. Зариня, И. А. Вййв :и;,А:„,A., А ксаар

Научно-производственное объедин ф" "вйьм актив

Институт химической и биологиче о Эстоф ой ССР и Опытный завод органического с еаза 1 3(Института химии АН Эс

{72) Авторы изобретения

{71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности.

Известен способ получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центрифугирования, хроматографического разделения с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования Dg .

Однако этот способ не обеспечивает высокой активности и степени чистоты препарата (степень очистки 2-3 раза, содержащие эндонуклеазы

5 ЕА/мг).

Цель изобретения - повышение ак:тивности и степени чистоты.

Цель достигается тем, что согласно способу получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центрифугирования, хроматографического разделения с последующим выделением це- 2в левого продукта в процессе элюирования, растворение яда проводят в растворе уксуснокислого аммония, после центрифугирования надосадочную жид2 кость подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-100, полученный раствор концентрируют ультрафильтрацией, ультрафильтрированный раствор хрома- тографируют на колонке с карбоксиметилцеллюлозой и элюируют раствором уксуснокислого аммония, причем удельную электропроводность элюэнта берут в градиенте от (1.7-1.9) ° 10 S см" . до (63-65) ° 1О S см ".

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония, центрифугируют, осадок выбрасывают, надосадоч- ную жидкость используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят с раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью (1516) - 10 S см ", полученные фракции экзонуклеаэ с приблизительно одинаковым молекулярным весом обессоливают до удельной электропроводности раствора (1,7-1,9) -10 S см-" и кон3 942 центрируют с помощью ультрафильтрации. Полученную смесь наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой при линейном градиенте элюирования от удельной электропроводности раствора уксуснокислого аммония (1,7-1,9) х х 10 3S см " до (63-65) -10 S см-" при постоянной рН среды, получают три белковых пика. Фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют (II пик) и высушивают лиофильно, Степень очистки 25-30 раз; активность фосфодиэстеразы 0,32-0,4 ед/мг; примесь эндонуклеазы (рибонуклеазы) отсутствует; примесь 5 -нуклеотидазы менее 2,8 10 ед/мг; примесь неспецифической фосфомоноэстеразы менее

4,5 10 ед/мг.

Пример 1. К 4,8 г яда гюрзы добавляют 50 мл раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроф водностью 15,3 10 > S см, смесь медленно перемешивают в течение 30 мин при 4 С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15.3 -10 см ) колонку с сефадексом Г-100 сверхтонким (размеры колонки 4,2 х 140 см) наносят раствор яда.

759

Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,3 ° 10 S см " со ско ростью 13 мл/ч и собирают фракции по

15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью

"Увикорда-11". Получают 9 белковых пиков. В I u II пике фракции, которые имеют фосфодиэстеразную активность, объединяют (объем 200 мл) и ультрафильтрируют до выхода 20 мл нуклеазногс раствора с удельной электропроводностью 1,7-10 S ; доводят рН

103-ной уксусной кислотой до рН 5,5

Ультрафильтрированный раствор наносят на уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность раствора 1,7 х х 10 S см "J колонку карбоксиметилцеллюлозы КМ-52. Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония рН 5,5 (удельная электропроводность раствора 1,7 .10 S см )

-1 и начинают градиентное элюирование при постоянном рН 5,5, линейно увеличивая удельную электропроводность от 1,7.10 S см " (количество раст4 вора 1 л) до 63.10 > S см " (количество раствора 1 л).

Скорость элюации 45 мл/ч, собирают ся фракции по 15 мл. Оптическую плот5 ность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорда". Во фракциях определяют фосфодиэстеразную активность (субстрат Са соль-бис-пара-нитрофенилфосфата).

1р При ионообменной хроматографии на КИ-целлюлозе получают три белковых пика (II пик содержит фосфодиэстеразу).

Фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют (II пик выход 170 мл) и высушивают лиофильно.

Выход лиофилизированного препарата

31 мг; степень очистки 30 раз; примесь эндонуклеазы отсутствует; активность фосфодиэстеразы 0,39 ед/мг препарата; . примеси 5 -нуклеотидазы 2,6 -10 ед/мг примеси неспецифической фосфомоноэстеразы 2,9 ° 10 5ед/мг препарата; содержание белка 793.

25 Пример 2. К 5,0 г яда гюрзы добавляют 50 мл раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 16,0 ° 10 $ см, смесь медленно перемешивают в течение 4 ч. зв Растворенный яд центрифугируют при

5000 об/мин в течение 30 мин при 4 С.

Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации.

На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15,9-10 > S см ".) колонку с сефадексом Г-100 сверхтонким с размером колонки 4,2 х 1.40 см наносят раствор яда.

Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 16.10 S см " со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по

15 мл.

Содержание белка во фракциях определяют по экстинкции раствора при

280 нм на спектрофотометре Сф-4 в прямоугольных кюветах толщиной 1 см. По содержанию белка во фракциях рисуют

50 хроматограмму, получают 9 белковых пиков. В I u II пике фракции, имеющие фосфодиэстеразную активность, объединяют (объем 210 мл) и ультрафильтруют до концентрации 20 мл и удельной электропроводности раствора 1,89 х

55 х 10 Я см ". Доводят рН уксусной кислоты до 5,5.

Ультрафильтрированный раствор на- носят на уравновешенную раствором формула изобретения

Тираж 714

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная 4

5 9427 уксуснокислого аммония (удельная электропроводность раствора 1,9.10 ЗS см колонку карбоксиметилцеллюлозы KM-52.

Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония (pH 5,5, удельная электропроводность 1,9 х х 10 S см-") и начинают градиентное элюирование при постоянном рН 5,5, линейно увеличивая удельную электропроводность от 1,9 ° 10 S см " (ко- 1о личество раствора l л) до 65 ° 10 >S см" (количество раствора 1 л).

Скоростью, элюции 45 мл/ч собирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность определяют в каждой фракции.

8о фракциях определяют фосфодиэстеразную активность (субстрат Са соль бис-пара-нитрофенилфосфат).

Фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют, выход 180 мл и высушивают лиофильно.

Выход лиофилизованного препарата

40 мг; степень очистки 25 раз; примесь эндонуклеазы отсутствует; активность Фосфодиэстеразы 0,31 ед/мг; ак-gg тивность неспецифической фосфомоноэстеразы 2,.6 .10 ед/мг; содержание белка 95>.

Лиофилизированный ферментный препарат полностью сохраняет активность в течение 6 мес при хранении при

4о, Определение активностей ферментов.

Активность фермента фосфодиэстеразы определяют с бис-и-нитрофенилфос фатом кальция, который расщепляется под действием фермента с образованием и --нитрофенола. 3а единицу актив,ности фосфодиэстеразы принимают количество фермента, которое освобождает 40

1 мкмоль -нитрофенола в 1 мин при

25оСАктивность 5 -нуклеотидазы примеси в препарате фосфодиэстеразы определяют по количеству неорганического 4 фосфора, который образуется при расщеплении ферментом 5 -АМФ.

3а единицу активности 5 -нуклеотидазы принимают количество фермента, который отщепляет 1.мкмоль неорганического фосфора за 1 мин при 25ОС.

Активность неспецифической щелочной фосфомоноэстеразы определяют с

Il-HèòðîôåHèëôîñôàòoì, который,под действием фермента расщепляетдя с

5Ь

ВНИИПИ Заказ 4936/8

59 6 образованием и-нитрофенола. 3а единицу активности неспецифической щелочной фосфомоноэстеразы принимают количество фермента, которое освобождает

1 мкмоль п -нитрофенола в I мин Ilpu

25 С.

Активность фосфодиэстеразы и ферментов примесей выражают на содержа- ние белка в препарате, которое определяется по методу Лоури. Рибонуклеазную активность определяют IlO гидролизу рибонуклеиновой кислоты. 3а единицу активности принимают количество фермента, вызывающее нарастание

В2 на 0,1 в течение 10 мин при

25оС

Технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в экономии змеиного яда за счет увеличивания качества ферментного,препарата (увеличивание удельной активности, не содержит примеси других белков).

Высокие показатели чистоты являются предпосылкой практического использования фосфодиэстеразы.

Способ получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центрифугирования, хроматографического разделения с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и степени чистоты, растворение яда проводят в растворе уксуснокислого аммония, после центрифугирования надосадочную жидкость подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-100, полученный раствор концентрируют ультрафильтрацией, ультрафильтрированный раствор хроматографируют на колонке с карбоксиметилцеллюлозой и элюируют раствором уксуснокислого аммония, причем удельную.электропроводность элюэнта берут в градиенте от (1,7-1,9) х х 10 S см "до (63-65)-10 S см ".

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Розенталь Г. Ф. и др. Изв. АН

Латвийской CCP. сер. "Химия", 1970, N 5, с.623.