Способ получения тимостерина а

 

- ав ю

С. Н. Тихонова, В. П. Вендт и И. О. Трикаш (72) Авторы изобретения

Ордена Трудового Красного Знамени институй биохимии им. A. В, Палладина (7! ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОСТЕРИНА А

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства биологически активных препаратов из сырья животного происхождения.

Известен способ получения биологически активных веществ из тимуса телен- 5 ка, стимулирующих созревание Т-лимфоцитов, включающий гомогенизацию измельченного сырья, выделение активной фракции, осаждение, очистку с помощью хроматографии и элюирование целевого . продукта 11 .

Однако известным способом выделяют биологически активные вещества, представляющие собой гетерогенные препараты.

Известен способ получения тимостерина А из тимуса телят, включающий измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение липид-белко20 вого комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящем спирте, последующую его экстракцию органическим растворителем, очистку

2 полученного экстракта хроматографией на колонке и элюирование целевого продукта смесью органических растворителей (2) .

Однако известный способ не обеспечи вает выделения целевого продукта с до- l таточно высоким выходом и чистотой.

Целью изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения тимостерина А из тимуса телят, включающем измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение Йипид-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи B кипящем спирте, последующую его экстракцию органическим растворителем, очистку полученного экстракта хроматографией на колонке и элюирование целевого продукта смесью органических растворителей, измельченный тимус животных инкубируют в физиологическом растворе при

3 М01 5-37 С в течение 30-60 мин, далее после осаждения липид-белкового комплекса и его обработки кипящим раствором щелочи в этаноле проводят зкстракцию полученного осадка диэтиловым эфиром, 5 а очистку экстракта осуществляют вначале ацетоном, затем недоседочную жидкость упаривают, остаток растворяют в бензоле, наносят на колонку с окисьг> алюминия и элюируют целевой продукт последовательно гексаном и затем гексанбензолом при соотношении (1:2) - (1;1) и бензол-диэтиловым эфиром при соотношении (90:95) - (10:5).

Способ поясняется следующими приме13 реми»

Пример 1, 10 кг массы, очищен« ной от кровеносных сосудов тимуса телят и измельченной не гомогенизаторе, инкубируют с 30 л физиологического рест- 6 вора при 37 С в течение 60 мин. Полученную смесь фильтруют через капроновый фильтр и в фильтрат постепенно добавляют охлажденный ацетон лри - з С для осаждения лилид-белкового комплекса

2$ (ЛБК). Из указанного количества сырья получается 900 г ЛБК, который омыляют 20%-ным этанольным раствором КОН при 78 С в течение l ч и неомыляемую фракцию экстрагируют диэтиловым эфиром, Зй

Для очистки экстракта от холестерина проводят кристаллизацию в ацетоне, после чего надосадочную жидкость неомыляемой фракции упаривают в вакууме, затем растворяют в бензоле и наноаят на ко- M лонку с окисью алюминия. Колонку промывают сначала гексаном для удаления сквалена, затем смесью гексана и бензоле при соотношении 1:1 для удаления пигментов, а фракцию, содержащую целевой про- 46 дукт, элюируют смесью бензол-диэтиловый эфир при соотношении 90:5.

Контроль за составом каждой порции элюатов осуществляют с помошью газового хроматографа марки Ckroyn= 31. 45

Фракцию, содержащую целевой продукт, концентрируют и наносят на тонкий слой силикегеля с 13% гипса, разгоняют в бензоле. Целевой продукт находится в хроматографической зоне с R,g = 0,22, его элюируют диэтиловым эфиром. Йосле отгонки растворителя получают желтоватые кристаллы, которые залаивают в ампулу. Выход целевого препарата 25 мг.

Пример 2. 10 кг измельченного тимуса телят инкубируют лри 35 С в течение 30 мин. Из указанного количества сырья получают 900 r ЛБК. Осадок

ОЮ 4

ЛБК подвергают щелочному гидролизу в

12% этанольном растворе КОН при 78 С в течение 2 ч. Неомыляемые вещества

ЛБК зкстрагируют дизтиловым эфиром.

Удаление основной массы холестерина неомыляемой фракции проводят кристаллизацией в ацетоне, после чего надоса« дочную жидкость концентрируют в вакууме и подвергают колоночной хроматографии на окиси алюминия, Очистку от сквалена и пигментов проводят, как в примере 1.

Фракцию,-содержащую целевой продукт элюируют смесью бензол:дизтиловый эфир (90:10), которую после упаривания на роторном испарителе, хроматографируют на тонком слое силикагеля ЛС 5/400 с 10% гипса в бензоле. Белевой продукт, расположенный в зоне, характеризующейся 1у 0,25, элюируют из адсорбента диэтиловым эфиром. Выход препарата 20мг.

Пример 3. 10 кг измельченного тимуса дикого северного оленя инкубируют при температуре 36 С в течение 40мин в физиологическом растворе. Из указанного количества сырья получают 1,2 кг лилид-белкового комплекса (ЛБК). Сладок ЛБК омыляют 15%-ным этанольным раствором„КОН при температуре кипения этанола 78 С в течение 1,5 ч, а затем о экстрагируют, как описано в примере 1.

Очистку от холестерина и сквалена проводят так же,как и в примере 1. Удаление пигментов осуществляют на колонке элюированием смесью гексан-бензол в соотношении 2:1, а затем бензол-диэтиловым эфиром в соотношении 95:5. Выход продукта 30 Mr.

Степень очистки целевого продукта контролируют на газожидкостном хроматографе СЬ)"ОМ = 31 при следующих стандартных условиях: колонка 1,8 м и 6 мм, заполненная носителем СЙГОюОЬ31

М-АФЭМСВ, обработанным 3%-ным ЖСои BE. 30 (CbeVnOPOC ЧССР), диаметр частиц 0,160-0,200 мм, газноситель-аргон, скорость 25 ммlмин. Рабочая температура колонки 250 С, темо пература инжектора 280 С. Скорость водорода 50 мл/мин, скорость воздуха 500мл/мин, Относительное время удерживания целе/

aoro продукта {ло сравнению с холестерином) составляет 2,23. время удерживания целевого

2,23 = йродукта время удерживания холестерина г

Биологическая активность подтверждена экспериментально в опытах на животных, у которых после введения препарата на% 10019 блюдали стимуляцию иммунологического ответа. Инкубирование в течение 60 мин в среде с предлагаемым препаратом лим фэцитов периферической крови больных туберкулезом, ревматоидным артритом вос 5, станавливает их функционагп.ную активность, процесс бласттрансформации стимулируется, способность к розеткообразованию возрастает до нормальных показателей, т.е. предлагаемый препарат из тимуса способен стимулировать дефектные лимфоциты.

Заявляемый способ позволяет получить высокоочищенный препарат (85-90%) из сырья животного происхождения с выходом 2-3 мг из 1 кг тимуса. При упрощении технологии получения целевого продукта увеличивается его выход в

2 раза и обеспечивается более высокая степень очистки. 20 формула изобретения

Способ получения тимостерина А из 2$ тимур телят, включающий измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение липид-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящем спир-Зэ те, последуюшую его экстракцию органиЗО 4 ческим растворителем, очйстку полученного экстракта хроматографией на.колонке и элюирование целевого продукта смесью органических растворителей, о т л и— ча ющ и йс ятем, что, с цельюповыщения выхода и чистоты целевого продукта, измельченный тимус животных инкубируют в физиологическом растворе при 35-37 С в течение 30-60 мин, далее после осаждении липид-белкового комплекса и его обработки кипящим раствором щелочи в этаноле проводят экстракцию полученного осадка диэтиловым эфиром, а очистку экстракта осуществляют вначале ацетоном, затем нщ осадочную жидкость упаривают, остаток растворяют,в бензоле, наносят на колонку с окисью алюминия и элюируют целевой продукт последовательно гексаном и затем гексан-бензолом при соотношении (1:2)-(1:1) и бензол-диэтиловым эфиром при соотношении (90:95)-(10:5).

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

% 706089, 1979, кл. А 61 К 37/24.

2. Автореферат, канд. диссертации

С. Н. Тихонова Исследование биологических свойств стеринов вилочковой железы», Киев, 1975.

Составитель B. Брусиловская

Редактор Н. Аристова Техред К.Мьшьо Корректор E Рошко

Заказ 1674/2 Тираж 711 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4