Способ включения веществ в липосомы

 

СПОСОБ ВКЛЮЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ В ЛИПОСОМЫ путем добавления спиртового раствора фосфолипидов в водный раствор исследуемого вещества с последующим отделением липосом от невключившегося материала, отличающийся тем, что, с целью увеличения внутреннего объема липосом, процесс включения веществ а липосомы проводят при температуре от -10 до -40 С в течение двух или более суток с послелук пшм нагреванием до комнатной темпёратуры

, Su„„1005?91.

СОЮЗ СОВЕТО ИХ

ОСЦН

РЕСПУБЛИН,А

ЗИ9 А 61 К 47/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ .".":

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ е

ГОС ДАРСтВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (:-"1) 3311712/28-13 (22) 03.07.81 ,(46) 23.03.83. Бкщ. % 11 (72) B.È. Закревский, В.П. Подзолков, и В.А. Мельников (7 1 ) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (53) 577.1(088.8) ,:(56) 1.ХМаепег D., Sanqham A.Ý.ÂòoñÈãð .ЩОРСАМ&.МСФее,1976, у. 443, ¹ 3, р. 629 634.

2,5atzti В., Кого КЭ. В1оефитп

ЫоРЪмь betel>1873, V, 298, р. 10151019. (54)(57) СПОСОБ ВКЛЮЧЕНИЯ ВЕ-ЩЕСТВ В ЛИПОСОМЫ путем добавления спиртового раствора фосфолипидов в водный раствор исследуемого вещества с последующим отделением липосом от невключившегося материала, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью увеличения внутреннего объема липосом, проаесс включения веществ в липосомы проводят при температуре от -10 до -40 С в теО чение двух или более суток с последукьщим нагреванием до комнатной температуры.

I 10057

Изобретение относится к биохимии, а именно к методам получения липосом, и может быть использовано в микробиологии фармакологии и медицине.

Известен способ приготовления липосом путем введения эфирного раствора липидов в водную фазу, содержащую включаемое вещество, с последующим испарением эфира при нагревании (1

Однако данный способ имеет ограни- 10 ченное применение из эа высокой температуры (55-60 С) водного раствора, включаемого вещества, из-за невозможности включать в липосомы термолабильные соединения. 15

Известен способ получения липосом, включающий приготовление спиртового раствора фосфолипидов, введение этого раствора s водный раствор включаемого вещества и отделения образовавшихся ли- щ посом от невключившегося материала путем ультрацентрифугирования, диализа или гель-хроматографии (2 3.

Однако известным способом получают липосомы с небольшим внутренним объ- 35 емом (около 4 мкл/мк моль липидов) и, соответственно, с низким процентом включения исследуемого вещества.

Белью изобретения является увеличение внутреннего объема липосом. 5а

Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу введения вещества в липосомы путем добавления спиртового раствора фосфолипидов в водный раствор исследуемого вещества с последующим

И отделением липосом от невключившегося . материала, процесс включения веществ в липосомы проводят при температуре от

-10 до -40 С в течение двух или более о суток с последующим HarpeBaHBeM до

46 комнатной температуры.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример. В 1 мл 96о этанола растворяют 62 мг .дипальмитоилфосфатидилхолина, 23 мг холестерина и 1,6 мг

45 дицетилфосфата. 560 мкл этанольного . раствора липидов (80 мкмолей) шприцом

91 2 тонкой иглой вводят в 8 мл раствора глюкозы — С (50 мкКи/мл) в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4). Об образовании липосом судят по резкому помутнению раствора. Суспензию замораживают при температуре -40 С и хранят в

- течение двух суток. По истечении этого срока препарат оттаивают при комнатной температуре и по 2 мл наносят на хроматографическую колонку (22" 200 мм), заполненную сефадексом (-25 (грубый).

Элюцию проводят 0,01 М фосфатным буфером рН 7,4, собирая фракции объемом 5 мл. Выход дипосом определяют по помутнению раствора визуально и спектрофотометрически при 330 нм. Фрак ции, содержащие.липосомы, объединяют.

Элюируемую свободную глюкозу-С 4обнаруживают измерением радиоактивности во фракциях и также объединяют. Измерение радиоактивности глюкозы-С + в препаратах липосом и невключившейся глюкозы проводят с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика РЖС-2М, испсльэуя сцинтилятор,ЖС-8. Суммарный внутренний объем липосом определяют по эффективности включения глюкозы-С в липосомы, выраженной в процентах. Расчет процента включения глюкозы-С" в лппосомы производят исходя из суммарной радиоактивности глюкозы-С в обе14 их фракциях. Процент включения глюкозы-С"4 в липосомы был равен 8,06. Внутренний объем липосом составлял 8,06мкл . на 1 мкмоль взятых липидов. Зля липосом, полученных по известному способу, эти величины составили 3,43 и 3,43 мкл соотве тс твенно.

Способ позволяет получать липосомы с большим внутренним объемом, чем в .известном способе. B таблице приведены данные сопоставительного анализа по определению внутреннего объема липосом, полученных предлагаемым и известным способом, т.е. включение глюкозы-С . 1 в липосомы до и после замораживания и оттаивания.

3,43

4,86

Без замораживания (известный способ)

Замораживание (1 сут) 30 16 87806

4537 887 25

3,43

4,86

10057 91

Продолжение таблипы

Замораживание (2 сут) 8,06

8,06

8064 99556

Замораживание (3 сут) 8,84

8,84

80 19 82725

Составитель Г, Крюкова

Редактор Н, Джуган Техред Л.Пекарь Корректор И. Шулла

Заказ 1 969/6 Тираж 7 1 1 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/S

Филиал ППП .Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Двухсуточная инкубания при комнатной температуре, беэ замораживания не приводит.к увеличению внутреннего объема липосом, Электронномикроскопическое изучение, липосом, полученных по предлагаемому

В способу, показало увеличение их размеров, по сравнению с липосомами, получений ными известным способом, с сохранением монобислойной структуры.