Способ иммобилизации клеток микроорганизмов

 

,SU„„1013471

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5р С 12 И 11/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3245391/28-13 (22) 09.02.81 (46) 23.04.83. Бюл. N .15 (72) В. Г. Озереденко, В. В. Сан, Т. И. Стручалина и В. А. Афанасьев (71) Институт органической химии

АН Киргизской CCP (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. О. Petre С. Noel, О. Thomas.

А New Method for Cel1 I mucobilization"., Biot and Bioend, 1978, 20, 127-134, 2. Т. Toza et. al. 1 mucobilization of Enzymes and Microbial Cells Jsing Саггаяеепап as Matrix", В1оtechnol and Bioeng, 1979, 21.

1697-1709 °

:(54)(57) 1, СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ

КЛЕТОК МИКРО(ОРГАНИЗМОВ путем обработки клеточной суспензии раствором полисахарида с последующим гелеобразованием и добавлением гексаметилендиамина и глутарового альдегида, отличающийся тем, что, с целью повышения активности получаемого Ьиокаталиватора, в качестве полисахарида используют полиурониды.

2. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют клетки Bac1l luз subti1is q процесс ведут при следующем весовом соотношении компонентов полиурониды: клетки (в расчете на белок): 54-ный раствор глутарового альдегида: гексаметилендиамин 1:(0,06-0,15):(272-70 ): (1,56 - 15, 6 ) .

4 1013

Изобретение относится к биоорганической химии и может быть использовано в химической промышленности °

Известен метод иммобилизации

5 ,клеток микроорганизмов, обладающих

Р-галактозидазной активностью в пористых частицах, получаемых обраЬоткой смеси Ьычьего альбумина и микробных клеток глутаровым альдеги- 10 дом при 4 С после замораживания до -30"С, вследствие чего образуется пористая структура, содержащая 70 мг клеток на 1 г сухого биокатализатора.

Активность получаемого препарата сбставляла 7,5-g4 от исходной активности биокатализатора (1 ).

Недостатком этого способа является недостаточно высокая активность получаемого биокатализатора.

Наиболее близким по технической сущности к изоЬретению является cnocob иммобилизации клеток микроорганизмов путем обработки раствора каррагенана клеточной суспензией с 25 последующим гелеобразованием и добав« лением гексаметилендиамина и глутарового альдегида (2 ).

Применяемый в качестве полисахар.ной матрицы каррагенан представляет собой полисахарид из морских водорослей, обладающий молекулярным весом

100 000 - 800 000. Состоит из элементарных структурных единиц р -0-галактозосульфата и 3,6-ангидро-L 0-галактозы. Гелеобразование каррагенана обы- З5 чно вызывается добавлением ионов металлов, аминов, органических растворителей либо охлаждением до 10 С. Добавляемые в процессе получения гексаметилендиамин и глутаровый альдегид способствуют укреплению пространственной решетки геля и повышению операционной стаЬильности биокатализатора.

В качестве микроорганизмов обычно используют Е. coli, Вас. ammoniagenes u Streptomyces phaeochromogånås,. при этом выход по активности составляет для клеток E. coli - 46,84, В.ammoniagehes - 60,01 и S. phaeo- .

chromogenes - 54,1В по сравнению с нативными клетками микроорганизмов, Недостатками известного способа являются использование экзотического полисахарида,выделяемого из морских 55 водорослей, а также недостаточно высокая активность получаемого биокатализатора.

471 2

Целью изобретения является повышение активности биокатализатора.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации клеток микроорганизмов путем обработки клеточной суспензии раствором полисахарида с последующим гелеобразованием и добавлением гексаметилендиамина и глутарового альдегида, в качестве полисахарида используют полиурониды.

При этом оЬычно используют клетки Bacillus зцЬ 11is и процесс ведут при следующем весовом соотношении компонентов полиурониды: клетки (в расчете на белок): 54-ный раст вор глутарового альдегида: гексаметилендиамин 1:(0,06-0,15): (27-270):

: (1,56-15,6), Сущность изобретения заключается в том, что в качестве матрицы используются полиурониды. Полиурониды (пектиновые вещества) - природный углеводный полимер, состоящий из неразветвленных цепей, которые построены из остатков д -0-галактуроновых кислот, связанных (1 — 4) связями, присутствуют в растворимой или нерастворимой форме практически во всех наземных растениях и в ряде водорослей.

Известно, что клеточные стенки микроорганизмов содержат полисахариды различного, сложного строения.

Количество полисахаридов в клетках микроорганизмов достигает 20-304 сухого веса клеток, Каждый индивидуальный полисахарид, обладающий только ему присущей структурой, оказывает сугубо специфическое действие на функциональную деятельность микробных клеток и тем мягче это действие, чем ближе эта структура к строению соЬственных полисахаридов микроорганизма. Полиурониды состоят из уроновых кислот, которые также входят в состав полисахаридов клеточной стенки микроорганизмов.

Все это, вероятно, и обуславливает более мягкий контакт и действие внешнего полисахарида с клеточной стенкой микроорганизма, меньше нарушая жизненные функции микробных клеток, что в свою очередь приводит к повжшению выхода активности иммобилизованных клеток.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет не только повысить активность биокатализатора, но и решить

Табли ца1

Количество добавляемых клеток, мл (22,5 мг белка на 1 мл) Показатели

5,0

Активность, ИкИ/мин на

1 мг белкаo,0562 o,о503 0,0545 o,0509

Процент сохранения активности

67,5

69,7

62,38

63,12

3 10\347 задачу замены труднодоступного каррагенана широко распространенными в природе полисахаридами - полиуронидами ..

Методика выделения полиуронида.

Растительное сырье (например, цитрусовое) измельчают, помещают в мешочек из .плотной ткани и заливают спиртом для удаления эфирных масел, пигментов и других примесей. Стакан 1в накрывают и ставят не менее чем на

1 ч на водяную баню при 60-70 С. Затем материал отжимают на воронке

Бюхнера и снова заливают, спиртом.

Операцию повторяют до тех пор, пока экстракт не станет лишь слабожелтого цвета. Отмытую массу помещают в колбу с 0,03 NHCl и нагревают.

1 ч на кипящей водяной бане. Горячую 2в вытяжку фильтруют через вату, остаTot дважды промывают на фильтре небольшими порциями горячей воды. По охлаждении фильтрат частично нейтрализуют аммиаком до слабо кислой. 2S реакции и упаривают до 60-80 мл. К остатку добавляют 2 обьема спирта.

Выпавший пектин отделяют центрифугированием. Сушат на воздухе.

Пример. K 0,370 г цитрусового полиуронида приливают 5 мл

0,1 И фосфатного буферного раствора рН 7,5 и нагревают до 80оС до растворения, затеи охлаждают до

37-чОоС и добавляют 2 мл суспензии35

8 табл . 2 показана зависимость активности иммобилизованных клеток. от количества армирующих агентов, т.е. от 54 глутарового альдегида

1 ф ,клеток с содержанием белка 22,5 мг/мп, Тщательно перемешивают и приливают

1.,5 мл 0,5 M CaC12, полученный гель отжимают на воронке Бюхнера, продавливают через сито с диаметром отверстий 1 мм и к гранулированному гелю добавляют 5;10 Ъ (или 0,58 г) гексаметилендиамина в 5 мл 0,5 И

СаС1, перемешивают 2-3 мин и прили-. вают 5 -10 М (или 10 мл 54-ного раство. ра) глутарового альдегида °

Таким образом, весовое соотношение добавляемых компонентов, если количество полиуронида (0,370 г) взять за единицу, а также ведя расчет на белок используемых клеток (0,045 г), будет следующим: полиуронид:белок клеток: 54-ный глутаровый альдегид:гексаметилендиамин= .

=1:0,06:27:1,56.

Смесь осторожно перемешивают 1020 мин при 5 С и переносят на ворон-о ку Бюхнера, где тщательно промывают фосфатным буферным раствором при рН= 7,5. Получают 6 г геля, обладающего триптофансинтазной активностью в 69,74 от исходной. активности нативных клеток.

В табл. 1 показана -зависимость активности получаемого биокатализа- тора от количества добавляемых клеток при постоянном количестве полиуронида (0,370 г), 54-ного глутарового альдегида (10 мл) и гексаметилендиамина (0,580 г). и 1004 гексаметилендиамина, при постоянном количестве добавляемых кпе ток (2 мл с содержанием белка s

22,5 мг/мл) ..

1013471

Т а бл и ц а 2

2,32 3,48 5,80

Гексаметилендиамин, r 0,580 1,16

5ь-ный глутаровый альдегид, мл

60

100

Активность, мкИ/мин на 1 мг белка

0;0547 0,0564 0,0541 0,0595 0,0580.Процент сохранения активности

76,8 69,9 67,1

73,3 71,9

Составитель О, Скородумова

Редактор О. Поповка Техред il,Пекарь Корректор И, Демчик.Заказ 2942/34 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.. 4/5

Филиал Orlll "Патент", r. У город, ул. Проектная, 4

Предложенный способ иммобилизации !3 пользовать более доступное сыклеток микроорганизмов позволяет по- рье, присутствующее практически лучить биокатализатор с высоким вы- во всех наземных растени" ходом активности (до 69,7-703), ис- ях.