Способ получения тимусзависимых лимфоцитов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМУСЗАВИСИМЫХ ЛИМФОЦИТОВ путем нанесения лимфоцитов периферической крови на колонку с синтетическим волокном, пропитанным питательной средой, инкубирования колонки в термостате и элюирования тимусзависимых лимфоцитов из колонки питательной средой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта, в качестве синтетического волокна используют лавсан. (Л с:

СООЭ СОВЕТСНИХ

COUWI

РЕСПУБЛИК

ЗСЮ а 01Н

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТЗЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3281037/28-13 (22) 02.02.81 (46) 23. 04. 83. Бюл. В 15 (72) Е.В. Бененсон, Б.Б. Сагандыков, A.Ø. Сейсенбаев и С.К. Сагандыкова (71) Семипалатинский государственный медицинский институт (53) 612.112i94(088.8) (56) 1. Иммунологические методы.

Под. ред. Фримеля Х., И., 1979, с. 340.

2. Сочнев A.A. Выделение очищенных тимусзависимых лимфоцитов на колонке с нейлоновым волокном.-"Мик-

° робиология и эпидемиология", 1978, 9 11, с.97.

„.SUÄÄ101 3851 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИИУСЗАВИСИИЫХ ЛИИФОЦИТОВ путем нанесения лимфоцитов периферической крови на колонку с синтетическим волокном, пропитанным питательной средой, инкубирования колонки в термостате и элюирования тимусзависимых лимфоцитов из колонки питательной средой, отличающийся тем, что, с целью повыщения степени очистки целевого продукта, в качестве синтетического волокна используют лавсан.

101 3851 получают фракцию тимусзависимых лимфо

Изобретение относится к медицине в частности к способам получения фракции тимусэависимых лимфоцитов.

Известен способ получения лимфоцитов, включающий выделение лимфоцитов из лейкоконцентрата путем пропускания лейкоконцентрата через сорбенты, такие как дедероновую ткань, лолистирол, хлопковые и стеклянные волокна 11.

Недостатком укаэанного способа является невозможность получения очищенной субпопуляции тимусзависимых лимфоцитов. Способ позволяет получить лишь все лимфоциты.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения очищенной фракции тимусэависиьых лимфоцитов, предусматривающий получение лимфоцитов периферической крови человека, нанесение их на колонку с синтетическим волокном, пропитанным питательной средой, инкубирование колонки в термостате и элюирование тимусзависимых лимфоцитов иэ колонки питательной средой f2).

В качестве синтетического волокна используют нейлон. В результате цитов с содержанием 76,0+5,2% с примесью бурсазависимых лимфоцитов

1,5 + 0,4% °

К недостаткам известного способа относится значительная примесь нулевых клеток во фракции, обогащенной тимусзависимыми лимфоцитами, а также использование дорогостоящего импортного волокна..

Целью изобретения является повышение степени очистки целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тимусэависимых лимфоцитов, предусматривающему получение лимфоцитов периферической крови человека, нанесение их на колонку с синтетическим волокном, пропиТанным питательной средой, инкубирование колонки в термостате и элюирование тимусзависимых лимфоцитов иэ колонки питательной средой, в качестве синтетического волокна используют лавсан.

Сущность способа заключается в следующем.

Кровь из вены (10 мл ) забирают в пробирки с 0,2 мп гепарина. После о отстаивания в термостате при 37 С в течение 30-60 ° мин отсасывают плазму и наслаивают. на градиент плотнос-. ти верографина, центрифугируют при

400 45 мин. Лимфоциты отмывают трижды средой 199 и ресуспенэируют в этой питательной среде из расчета

4-5 .10 клеток/мл .

Лавсановое волокно промывают 23 раза дистиллированной водой и высушивают 24 ч при комнатной температуре. Затем туго заполняют шприц лавсаном до 5-миллилитровой метки с помощью поршня шприца. Через колонку пропускают 3-5 раз 0,1 н. раствор соляной кислоты, выпуская

его медленной струей, после чего промывают колонку 8-10 раз дистил>0 лированной водой. тщательно выдавливают из шприца дистиллированную воду. Наслаивают на колонку 5 мл среды 199, содержащей 5-10Ъ сыворотки крупного рогатого скота и дают

15 ему впитаться в лавсан, после этого поршнем шприца выдавливают питательную среду из лавсана. На шприц надевают инъекционную иглу, устанавливают шприц -в гнездо штатива для проби20 рок и надевают на конец иглы резиновую пробку для предотвращения вытекания суспензии лимфоцитов после заполнения колонки.На колонку наносят каплями

1 мл приготовленной суспенэии лимфоци25тов,сверху наслаивают питательную среду с таким расчетом, чтобы среда покрывала поверхность лавсана в колонке. После этого колонку помещают в термостат и инкубируют при 37 С 1 ч.

После окончания инкубации колонку извлекают из термостата, убирают пробку с кончика иглы и наслаивают на колонку 5-7 мл питательной среды.

С помощью поршня шприца выпускают медленной струей содержимое шприца в пробирку, сильным давлением на поршень шприца выдавливают питательную среду из лавсана. Клетки в элю- ированной фракции концентрируют центрифугированием.

40 В полученной фракции производят подсчет лимфоцитов в камере Горяева и окрашивают лимфоциты трипановым синим для оценки жизнеспособности клеток. Производят определение числ<

45 "гимусзависимых лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с бараньими эритроцитами и бурсазависимых лимфоцитов методом EAC-роэетко-; образования.

Пример 1. Исследование про изводили у 23 здоровых доноров. Готовят счспензию лимфоцитов крови. Лавсан промывают и высушивают в течение 24 ч при комнатной температуре, заполняют им шприц-колонку и пропускают 40 мл 0,1 н. соляной кислоты, после чего промывают колонку 100 мл дистиллированной воды, наслаивают

5 мн среды 199. На колонку наносят

60 каплями 1 мп приготовленной суспенэии лимфоцитов, сверху наносят питательную среду. Колонку помещают в термостат и инкубируют при 37ОС

60 мин. Затем проводят элюцию обогащенной фракции тимусзависимых лим1013851

Содержание субпопуляций, %

Число исследований убпопуляции лимфоцитов до выделения . после .выделения на колонке на колонке

Т-лимфоциты

87,7+1,35 (73-98 ) 1,44+0,45 (0-4 ) 54,2+3,47 (28-86) 10,9+1,64 (6-22 ) 23 (0,001 (0,001

В-лимфоциты

Нулевые лимфоциты

33, 1+5, 07 (7- 56 ) 10 (0,001

12,5+3,04 (2-20) Пример 2 Донор Б. Выделе. но 10 10 лимфоцитов. т-лимфоцнты составляют 45%, В-лимфоциты - 14%, О-лимфоциты-41% 5 106..Пимфоциты наслаивают на колонку с лавсаном, 5 ° 10 лимЬ фоцитов на колонку с нейлоном. Инкубация 60 мин при 37ОС. В элюате из колонки с лавсаном получают содержа- ЗО ние клеток: Т-лимфоциты — 94%, В-лимфоциты - 0%, О-лимфоциты. — 6%. В .элюате из колонки с нейлоном содер-, жится 86% Т-лимфоцитов, 2%- В-лимфоцитов и .12% О-лимфоцитов.

Пример 3 . .Донор К. Выделе -: но 12 10 лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографина. Т-лимфоциты составляют 54%, В-лимфоциты17%, О-лимфоциты - 29%. 5 10> лим- 40 фоцитов наслаивают на колонку с лавсаном, 5 10О лимфоцитов — на колонку с нейлоном. Инкубация 60 мин при

37 С. B элюате из колонки с лавсаном получают следующее содержание . 45 клеток: Т-лимфоциты — 98%, В-лимфоци" ты - 0%, 0-лимфоциты — 2%. В элю

Составитель С. Каспаров

Техред В.Далекорей Корректор С. Шекмар

Редактор П. Коссей

Тираж 871 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Эаказ 3008/53

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул. Проектная, 4 фоцитов 5-10 мл питательной среды со скоростью 20 капель/мин.

Процент жизнеспособности клеток. в полученной фракции составляет 95-99%, выход клеток 5-10% от исходного количества нанесенных sa колонку лимфоцитов.

Данные о процентном содержании субпопуляций лимфоцитов до и посла разделения на колонке представленй в таблице. из колонки с нейлоном содержатся

84% Т-.лимфоцитов, 2% В-лимфоцитов, 14% О-лимфоцитов.

Пример 4 Донор Г. Выделено 8%.10 лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографина. T-лимфоциты составляют 38%, В-лимфоциты17%, 0-лимфоциты — 45%. 4 106 лимфоцитов наслаивают на колонку с лавсаном, 4 ° 10 лимфоцитов - на колонку с нейлоном. Инкубация 60 мин .. при 37ОС. В элюате из колонки с лавсаном получают следующее содержание клеток: Т-лимфоциты — 86%, В-яимфоциты — 1%, О-лимфоциты - 13%. В элюате из колонки .с нейлоном содержится

70% Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов - 3%, О-лимфоцитов — 27%.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить содержание тимусзависимих лимфоцитов на -8-16% с одновременным снижением содержания

В-лимфоцитов и О-лимфоцитов соответственно на 2,0-2,2% и на 12-1ф%.