Способ получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТЙКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИДЙГОКСИНОВБК АНТИТЕЛ, отличающийся тем, что дигоксин окисляют периодатом лития и затем подвергают взаимодействию с эритроцитами барана при рН 7,,4 и соотношении окисленное производное дигоксина: эритроциты

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

О,И В Э

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3497 653/28-1.3

1 (22) 06.10.82 (46) 07.08.83. Бюл. 9 29 (72) И.Е.Ковалев, О.Ю.Полевая, Л.A.Башарова, И.A.Вербицкая и И.М.Корочкин (71, Научно-исследовательский инстиу тут по биологическим испытаниям химических соединений и 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И,Пирогова (53) 543.9 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

В 857875, кл. G 01 lV 33/92 1979.

2. Авторское свидетелвство СССР

Ю 909633 кл. С, 01 N 33/50s 1979.

3» Smith Т,N., Buther V.P,, НаЬех Е,, Biochemistry 1970, 9, W5, 331-337.

4. Buther V.P., Cher J,Р., Proc.

Mat. Acad. Sci. О.S.A. 1967, 57, 71-78.

-SU„40 А

ЭСЮ A 61 К 31/59; G, 01 и .33/50// б 500 (54) {57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТЙКУМА дЛя ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИДИГОКСИНОВЫХ

АНТИТЕЛ, отличающийся тем, что дигоксин окисляют периодатом лития и затем подвергают взаимодействию с эритроцитами барана при рН 7,0-7,4 и соотношении окисленное производное дигоксина: эритроциты (О, 5-0, 6) - 10 6 моль: (1, 8-2, О) . 10 "0

zo53140

0 0

ИЭО

ОН

ОН ОН дН

Изобретение относится к способу получения диагностикума, который может найти применение в медицине и биологии для выявления иммунного ответа на дигоксин и рефрактерности застойной недостаточности кровообра- щения прн ишемической болезни сердца в кардиологии.

Известные способы получения диагностикумов для выявления антител к лекарственным препаратамр например 10 барбитуратам И фенотиазимам,основаны на ковалентном связывании реакционйо способных производных фармакологических соединений с белковыми компонентами зритооцитов млекопитающих. f5

В этих способах в зависимости от структуры фармакологического препарата в качестве реакционноспособных производных использукт хлорформиаты иль диазониевые-соли и для получения каждого диагностикума подбирают конкретные условия проведения процесса температуру, рН раствора и соотношение исходных компонентов 1 и (.21, Для выявления.антиднгоксиновых антител в экспериментах на животных применяют метод равновесного диализа, в котором сыворотку крови инкубируют с радиоактивным дигоксином s течение 18 ч при 25ОC. Затем с помощью жидкостного сцйнтилляционного счетчи- 30 ка устанавливают концентрацию свободного и связанного с антителами дигоксина и на основании этих данных . рассчитывают концентрацию антидигоксиновых антител в сыворотке крови (3 . 35

Недостатком этого способа является необходимость использования дорогостоящих реактивов (радиоактивный дигоксин) и оборудования. (сцинтилляционный счетчик) . 40

Кроме того, процесс выявления антидигоксиновых антител длителен (25 ч).

Известен способ ковалентного связывания дигоксина с белками при помощи периодатного окисления и последую-45 щего восстановления боргидрадом натГ ркя, при этом взаимодействие дигоксина с человеческим сывороточным аль-, бумином осуществляют рН 9,5 в присутствии большого избытка боргидрида натрия .(4 1.

Однако указанным способом получить диагностикум для выявления. антидигоксиновых антител не удается, так как невозможно провести аналогичные превращения с белковыми компонентами мембраны эритроцитов. В этих условиях наблюдаются лизис и агглютинация. эритроцитов (осуществление реакции пассивной гемагглютизации (ПГА)z с помощью которой выявляются антндигоксиновые антитела, невозможно с использованием полученного производного дигоксана) .

Предлагаемый способ получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител заключается в том, что дигоксин окисляют периодатом лития н затем подвергают .взаимодействию с эритроцитами барана(ЭБ) при рН 7,0-7,4 и соотношении окисленное производное дигоксина: эритроциты (О, 5-0, 6) - 10 "моль -. (1, 8- 2, 0) 10 "О .

Способ осуществляют следующим образом.

Раствор дигоксина в физиологическом растворе обрабатывают избытком периода лития в присутствии небольших количеств органических растворителей — этанола, диоксана и этнленгликоля. Далее раствор добавляют к суспензии ЭБ, суспендированных в забуференном физиологическом растворе при рН 7,0-7,5 и инкубируют 1 ч при перемешивании и 20-25 С. В реакцию вводят (0,5-0.,б)-10 бмоль дигоксина на (1,8-2,0) ° 10 эритроцитов. уменьшение количества вводимого дигоксина приводит к уменьшению чувствительности диагностикума, а увеличение - к лизису и гибели эритроцитов в условиях проведения процесса.

Ковалентное связывание дигоксина с ЭБ протекает по схеме: 1033140 он он он

ВНИИПИ Заказ 5467 7 Тираж 713 Подписное

Филиал ППП Патент, г. жгород,ул. роектная, I

Пример 1» Раствор 2 Mr (2,6-10 моль) дигоксина -в 8 мл физиологического раствора добавляют к. раствоРУ 6 мг периодата лития в 5

1,5 мл воды, 0,4 мл этанола и 0,1 мл диоксана, вйдерживают 30 мин и добав ляют 0,05 мл 0,1 N раствора этиленгликоля в физиологическом растворе. Полученную реакционную массу добавляют по каплям при перемешивании в 4 мл

100%-ных (упакованных ) ЭБ, сус- -, пендированных в 20 мл забуференного .физиологического раствора при рН .7,4, перемешивают 1 ч при 20-25 С и триждй отмывают эритроциты физиологическим раствором до получения прозрачного. супернатанта.

Hp и м е р 2. Как в примере .иэ 1 мг дигоксина, 3 мг периодата лития и 4 мл 100%-ных ЭБ получают 40 сенсибилизованные ковалентным свйзыванием с дигoKcHHoM ЭБ.

Пример 3. Аналогично приме- . ру 1 0,5 мг дигоксина, 1,5 мг периодата лития и 4 мл 100Ъ-ных ЭБ получа-45 ют сенсибилиэированные ковалентным .связыванием с дигоксином ЭБ.

Пример 4. Титры антидигокси. новых антител определяют реакцией пассивной гемагглютинации (НГА) . Для этого в каждую лунку микротитратора вводят по 0,025 мл физиологического раствора. Повом в первую лунку ряда вносят 0,025 мл анализируемой сыворотки крови больных, которую предварительно дексмплементируют при 57 С . в течение 40 мин. Раститрование сыворотки проводят последовательньм переносом из каждой предыдущей в каждую последующую по капле раствора.

Затем в каждую лунку добавляют по 60 капле 1%-ной суспенэии ЭБ, ковалентно связанных с дигоксином (пример 1)и пластины инкубируют 2 ч в термостаге при 37ОC. В качестве контрольных опытов проводят аналогичные Реакции исследуемых сывороток с нормальными

ЭБ. Кроме того, излучают возможность .неспецифической агглютинации сыворотками сенсибилиэированных дигоксином

ЭБ. Агглютинацию эритроцитов оценивают визуально по характеру осадка в лунках. Последнее разведение сыворотки, при котором наблюдается агглютинация, принимают за титр антител при отсутствии агглютинации в контт рольных опытах. По этой методике в клинических условиях выявляют антидигоксиновые антитела в сыворотках крови 70 больных с застойной недос-. ,таточностью кровообращения, длительное время леченных сердечными гликозидами, в том числе дигоксином.

Титр антидигоксиновых антител в реакции ПГА составил 1:4, l:8, 1:16, 1:32 и l:64 у 17,5 12,5 и 7 больных соответственно. у 24 больных { 35 ) нтидигоксиновые антитела не выявлеФ

Использование предлагаемого способа получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител позволит быстро, экономично, методически просто и на отечественном оборудо вании и реагентах выявлять антидигоксиновые антитела у больных в клинических условиях и диагностировать рефрактерную форму недостаточности кровообращения при ишемической болезни сердца. Способ получения диагностикума прост в исполнении, экономичен и не требует применения дорогостоящего оборудования, В связи с этим предлагаемый способ может найти широкое применение в клиниках страны.