Способ получения окрашенного диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных и других заболеваний

 

Использование: в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности для определения антигенов и антител инфекционных и онкологических заболеваний, алкоголизма, наркомании, допинг-контроля, СПИД. Сущность изобретения: способ получения окрашенного диагностикума, включающий сенсибилизацию латекса типа - ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, оболочка - сополимер стирола и солей цинка и меди ненасыщенной карбоновой кислоты при массовом соотношении звеньев 1 : 0,3 - 3,0 : 0,3 - 3,0, причем латекс предварительно выдерживают в буфере при рН 6,5 - 9,0 в присутствии 0,15 - 5,0 мас.ч от массы полимера диметилдитиокарбамата натрия в течение 1 - 3 мес с последующей сенсибилизацией при рН 7,0 - 9,0 и инкубированием сначала при 37 - 56°С в течение 80 - 300 мин, затем при 2 - 8^oС в течение 24 - 72 ч. 8 табл.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности, а именно к способу получения диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных и онкологических заболеваний, алкоголизма, наркомании, допинг-контроля и СПИД.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностикума для определения антигенов и антител различных заболеваний, в частности антигенов (HBsAg) вируса гепатита B, согласно которому полистирольный латекс сенсибилизируют антителами в 0,1 М глициновом буфере при pH 7,0, а затем осуществляют инкубирование при 37^oC в течение 2 - 8 ч [1].

Диагностикум, полученный этим способом позволяет выявить HBsAg вируса гепатита B только в концентрации 1 мкг/мл белка, ему свойственна достаточно высокая частота ложнополижительных реакций (30 - 40%). Специфичность такого диагностикума выражается величиной 68,02 ± 0,88. Кроме того, получаемый диагностикум позволяет получать результаты исследования через 20 мин.

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности диагностикума к белкам и органическим веществам.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения окрашенного диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных заболеваний, включающем сенсибилизацию модифицированного полистирольного латекса антителами или антигенами в буферном растворе при pH 7,0 и инкубирование сенсибилизированного латекса, используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, оболочка - сополимер стирола и солей меди и цинка ненасыщенной карбоновой кислоты при массовом соотношении звеньев 1 : 0,3 - 3,0, причем указанный латекс предварительно выдерживают в буфере pH 6,5 - 9,0 в присутствии 0,15 - 5,0 мас.ч. от массы полимеры диметилдитиокарбамата натрия в течение 1 - 3 мес с последующей сенсибилизацией при pH 7,0 - 9,0 и инкубированием сначала при 37 - 56^oC в течение 24 - 72 ч. Полученный диагностикум можно использовать для определения HBsAg вируса гепатита B в концентрации 1 пг/мл, гепатита A в концентрации 1 пг/мк, антигенов онкологических заболеваний в концентрации 10 пг/мл, белков допинг-контроля и агкоголизма в концентрации 50 пг/мл, а также сыворотки крови больных СПИД, содержащей вирус СПИД в известной концентрации. Диагностику можно проводить, используя сыворотку крови, слюну и мочу больного.

Специфичность диагностикума составляет 97,0± 2,2.

Для диагностики антигенов и антител инфекционных и других заболеваний используется метод активированных частиц (МАЧ), заключающийся в том, что оценка результатов реакции производится по степени активирования латексных частиц, визуально или оптическим прибором. Степень активирования частиц. Оценка результатов МАЧ, +++ - крупные однородные хлопья с небольшим количеством более мелких на слегка мутном фоне, положительный результат; ++++ - крупные хлопья на полностью прозрачном фоне, положительный результат; ++ - средних размеров частицы на мутном фоне, сомнительный результат; + - мелкие зерна частиц на мутном фоне, отрицательный результат; - - мутный фон, без частиц зерен, контроль сходный с диагностикумом, отрицательный результат.

Способ получения латекса типа ядро-оболочка и диагностикума иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. С целью получения полистирольного латекса в реактор загружают 10 мас.ч. стирола, 0,1 мас.ч. персульфата калия, 89,9 мас.ч. воды, и реакционную смесь термостатируют при перемешивании при 70^oC до полной конверсии мономера.

К части (A) полученного полистирольного латекса добавляют 1 мас.ч. стирола от общей массы полимера (A), 1,0 мас.ч. оксиэтилированного нонилфенола ОП-7, 0,3 мас.ч. метакрилата цинка, 0,5 мас.ч. персульфата калия. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов в течение 15 - 20 мин и термостатируют при 70^oC в течение 2 ч. Затем вводят 0,5 мас.ч. диметилдитиокарбамата натрия в виде 1%-ного водного раствора, латекс отмывают диализом против 20 объемов дистиллата от водорастворимых примесей.

К части (B) полистирольного латекса добавляют 1 мас.ч. стирола от общей массы полимера (B), 0,3 мас.ч. метакрилата меди (Cu²⁺), 1,0 мас.ч. ОП-7, 0,5 мас. ч. персульфата калия. Латекс перемешивают в течение 15 - 20 мин и термостатируют при 70^oC в течение 2 ч. Латекс охлаждают и отмывают диализом. Части латексов (A и B) смешивают и используют для получения диагностикума.

Латекс характеризуется размером частиц 0,5 мкм и адсорбционной насыщенностью поверхности частиц эмульгатором 30%.

Латекс перед сенсибилизацией выдерживают в буферном растворе, например, 0,01 М глицерино-глициновом буферном растворе, pH которого 6,5 в течение 1 мес.

Затем латекс разводят глициновым буферным раствором до 2%-ной концентрации и смешивают в соотношении 1 : 1 с моноклональными антителами в буферном растворе при pH 7,0. Полученную смесь последовательно инкубируют в 0,01 М глициновом растворе при pH 7,0 в течение 80 мин при 37^oC, затем 24 ч при 2^oC.

Латекс используют также для получения комбинированных диагностикумов, например, к различным специфическим антигенам различных онкологических заболеваний.

Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1 - 8.

Пример 2. Латекс получают по примеру 1, но используют 3,0 мас.ч. метакрилата меди, 3,0 мас.ч. метакрилата цинка и 5,0 мас.ч. диметилтиокарбамата натрия.

Полученный латекс инкубируют в 1 М глицерино-глициновом буферном растворе при pH 9,0 в течение 3 мес. Затем концентрацию латекса доводят с помощью глицинового буферного раствора до 2%, после чего смешивают равные объемы 2%-ного латекса и моноклональных антител в 1 М глициновом буферном растворе при pH 9,0. Сенсибилизированный латекс инкубируют в течение 300 мин при 56^oC, а затем при 8^oC в течение 72 час.

Результаты диагностических исследований приведены в таблицах 1 - 8.

Пример 3. Получают латекс по примеру 1, но используют по 0,1 мас.ч. метакрилатов цинка и меди и 0,15 мас.ч. диметилдитиокарбамата натрия.

Результаты приведены в табл. 1.

Пример 4. Получают латекс по примеру 1, используют по 5 мас.ч. метакрилатов меди и цинка, диметилдитиокарбамат натрия ввести не удалось, латекс скоагулировал. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 5. Получают латекс по примеру 1, используют по 0,3 мас.ч. акрилата меди и цинка. Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1.

Пример 6. Получают латекс по примеру 1, используют по 0,3 мас.ч. итаконата меди и цинка. Результаты диагностических исследований приведены в табл. 1.

Формула изобретения

Способ получения окрашенного диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных и других заболеваний, включающий сенсибилизацию полистирольного латекса антителами и антигенами в буферном растворе при рН 7 и инкубирование сенсибилизированного латекса, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности к белкам и органическим веществам, в качестве латекса используют латекс типа ядро - оболочка, где ядро - полистирольный латекс, оболочка - сополимер стирола и солей цинка и меди ненасыщенной карбоновой кислоты, при массовом соотношении звеньев 1 : 0,3 - 3,0 : 0,3 - 3,0, причем латекс предварительно выдерживают в буфере при рН 6,5 - 9,0 в присутствии 0,15 - 5,0 ч. от массы полимера диметилдитиокарбамата натрия в течение 1 - 3 месяцев с последующей сенсибилизацией при рН 7 - 9 и инкубированием сначала при 37 - 56^oС в течение 80 - 300 мин, затем при 2 - 8^oС в течение 24 - 72 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4