Способ выделения и очистки гормонов цветения растений короткодневных видов

 

i; СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ГОРМОНОВ ЦВЕТЕНИЯ РАСТЕНИЙ КОРОТКОДНЁШЫХ ВИДОВ С применением спиртовой-экстра1кции из лиофилизированных листьев цветущих растений, о т л ичаю .щий с я тем, что, с целью получения препаратов высокой активкости ,, экстракцию осуществляют кипящим этанолом или другими полярными растворителями при 50-70 С с последующим упариванием полученного экстракта, растворением остатка в метаноле, отделением выпавшего после добавления воды хлорофилл-липидного осадка, упариванием маточного раствора , перерастворением осадка в метаноле, осаждением гликозиЛЬв, путем добавления хлороформа или других полигалоидированных углеводородов , упариванием надосадочной жидкости и дальнейшей хроматографической очисткой целевого продукта.. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку осуществляют на колонках с силикагелем КСК, которые элнжруют хлороформом, содержащим увеличивающееся количество этанола, при этом целевой продукт содержится во фракции, элюируемой смесью, (П содержащей 10 об. % этанола. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой продукт дополнительно очищают методом тонкослойной хроматографии на силикагеле о КСК в системе хлороформ-метанол, содержащей 8 об.% метанола, концентрируя его в зоне с R 0,2-0,4. :о эо DO 4 :А9

<Е OD

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ЙЮЛ ЦЪ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2564101/23-04 (22) 30.12.77 (46) 30.08.83. Бюл. В 32 (72) М.Х. Чайлахян, Н.Я. Григорьева и В.Н. Ложникова (71) Ордена Трудового Красного

Знамени институт физиологии растений им. К.A. Тимирязева АН СССР и Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского AH СССР (53) 577. 17 (088. 8) (56) 1. Патент ClQA 9 3235543, кл. 260-236.5, опублик. 15.02.66 (прототип) . (54)(57) 1; СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ГОРМОНОВ ЦВЕТЕНИЯ РАСТЕНИЙ КОРОТКОДНЕЙНЫХ ВИДОВ с применением спиртовой- экстракции из лиофилизированных листьев цветущих растений, о т л ичающий с я тем, что, с целью получения препаратов высокой активности, экстракцию осуществляют кипящим этанолом или другими полярными растворителями при 50-70 C c последующим упариванием полученного экстракта, растворением остатка в метаноле, отделением выпавшего после добавления воды хлорофилл-липидного осадка, упариванием маточного раствора, перерастворением осадка в метаноле, осаждением гликозидов, путем добавления хлороформа или других полигалоидированных углеводородов, упариванием надосадочной жидкости и дальнейшей хроматографической очисткой целевого продукта, 2. Способ по п. 1, о т л ич а ю шийся, тем, что хроматографическую очистку осуществляют на колонках с силикагелем KCK которые элюируют хлороформом, содержащим увеличивающееся количество этанола, при этом целевой продукт содержится во фракции, элюируемой смесью, содержащей 10 об. % этанола.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю- шийся тем, что целевой продукт С дополнительно очищают методом тонкослойной хроматографии на силикагеле . KCK в системе хлороформ-метанол, содержащей 8 об.Ъ метанола, концентрируя его в зоне с Я4 0,2-0,4.

1038343

25

45

55

65

Изобретение относится к способу выделения и очистки соединений, вызывающих цветение растений короткодневных видов, находящихся в неблагопрйятных для этого условиях длинного дня или непрерывного света, Эти соединения являются фитогормонами, регулирующими цветение растений,. которые способны зацветать в естественных условиях только после наступления короткого дня (8-10 световых часов в сутки) .

Эти соединения могут быть использованы для продвижения на север субтропических и тропических растений, а также регуляции цветения растений короткодневных сельскохозяйственных культур.Известен способ .выделения из листьев цветущих короткодневных растений дурнишника (Xanthium pensilvanicum Xanthium st ruma т1um) и подсолнечника (Не1ianthus annuus) гормонов, вызывающих закладку цветков у 503 опытных растений дурнишника, выращиваемых в условиях длинного дня (в опыте использовано 10 растений), заключающийся в экстракции в вакууме при 0 С кипящим метанолом о или другими полярными растворителями из лиофилизированных листьев цветущих растений с последующим упариванием экстракта и смешиванием остат ка с линолином )1J .

Недостатком известного способа является незначительная биологическая активность выделенных гормонов, поскольку лишь у 50% опытных растений отмечены морфологические сдвиги в дифференцировке апексов (закладка цветков) .

Цель изобретения — получение препаратов высокой активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения и очистки гормонов цветущих растений короткодневных видов, лиофилизированные листья подвергают экстракции кипящим этанолом или другими полярными растворителями при 50-70ос с последующим упариванием полученного экстракта, растворением остатка в метаноле, отделением выпавшего после добавления воды хлорофилллипидного осадка, упариванием маточного раствора, перерастворением осадка в метаноле, осаждением гликозидов путем добавления хлороформа или других полигалоидированных углеводородов, упариванием надосадочной жидкости и дальнейшей хромаграфической очисткой целевого продукта.

Причем хроматографическую очистку осуществляют на колонках с силикагелем КСК, которые элюируют хлорофор мом, содержащим увеличивающееся количество этаиола, при этом целевой продукт содержится во фракции, элюи-1 руемой смесью, содержащей 10 об.% этанола.

Кроме того, целевой продукт под-вергают дополнительной очистке методом тонкослойной хроматографии на силикагеле КСК в системе хлороформметанол, содержащей 8 об,В метанола, концентрируя его в зоне с R f 0,2-0,4 .

Биологические испытания полученного препарата проводят на проростках и сеянцах растений короткоднев ного вида мари красной (Chenopodium

rubrum), находящихся на непрерывном свету. Раствор активной фракции в воде с концентрацией 3 мг/мл вызывает 100%-ную закладку цветочных органов у проростков мари красной при нанесении в течение 3 дней

0,05 мл такого. раствора на верхушечную почку каждого иэ 10 опытных растений. Опыт с лроростками пов20 торялся 5 раз результаты одного,из них приведены в таблице.. Раствор активной фракции с концентрацией

30 мг/мл вызывает 100%-ное зацветаиие сеянцев мари краской при нанесении .в течение 18 дней 0,05 мл такого раствора на верхушечную почву каждого .растеиия. Контрольные растения, обработанные водой или раствором, веществ,. вьщеленных ио аналогичной методике из листьев Nicotiana tabacum, которые выращивалксь в условиях длйнного дня, оставались на 100% в вегетирующем состоя" нии. Опыт с сеянцами пОвторялся

9 раз (результаты.одного из них приведены в таблице).

В таблице показано .влияние активной фракции, выделенной из листьев короткодневных растений Х1сой1ана

tabacum на дифференциацию апексов проростков и зацветание сеянцев-, Пример. В трехгОрлую колбУ емкостью 2 л, снабженную мехаиической мешалкой и обратным холодильником, загружают 75 г лиофилиэирован ных листьев растений табака (Nicotiana tabacum) сорта "Мамонт", выращенных в условиях короткого дня.

Листья заливают 1,5 л спирта, нагревают смесь до кипения при работающей мешалке, кипятят 3 ч, а затем оставляют на ночь. Спиртовый экстракт декантируют, а листья экстра ируют в тех же условиях еще 3 ч.

Полученный экстракт объединяют с первичным спиртовым экстрактом и упаривают до постоянного веса в вакууме при t «с 40О. Остаток растворяют в 35 мл метанола и добавлением

80 мл воды высаживают основную массу хлорофилла и липидов. Водно-метанольный раствор фильтруют и экстрагируют гексаном (50 мл ° 31 для удаления остатков хлорофилла и липидов, Хлорофилл-липидный осадок растворают в гексане и проьывают водой

1038343

Опыт с проростками

Опыт с сеянцами

Ф число э ацве тших растений

Препарат, которым обрабо1 тани растения число обработанных растений число обработанных растений средняя оценка апексов по 5-бальной шкале

Водная суспензия активной фракции

25

10

Вода (контроль 1) Водная суспензия фракции, полученной аналогично активной

as листьев Nicotiana

tabac-um, выращенного на длинном дне (контроль 2) 22

10. Критерием активности исследуемых экстрактов служила степень дифференциации апексов (верхушечных почек) опытных проростков по отношению к апексам контрольных, установленная по ранее разработанной 5-ти бальной шкале: 1 балл — вегетативный апекс, 2 — начало перехода к,дифференциации апекса, 3 и 4 -. различные фазы дифференциации апекса, 5 — дифференцированный апекс.

Составитель В.Жестков

Редактор И. Ковальчук ТехредМ. Гергель Корректор А. Тяско

Заказ 6139/25 Тираж 387

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Проектная, 4 (30 мл ° 3), промывные воды присое диняют к основному водно-метальному раствору, который после этого упаривают до постоянного веса в вакууме при t 63 5 С. Остаток растворяют в

30 мп метанола и добавлением 220 мл хлороформа высаживают вязкий осадок глнкозидов, легко сбивающийся в комок. Надосадочную жидкость сливают, гликоэидный осадок вновь растворяют в 25 мл метанола и высаживают гликозиды 200 мп хлороформа. Объединенные надосадочные жидкости упаривают до постоянного веса и получают

2,53 г смеси сухих веществ, которую объединяют с еще 5,27 г такой же смеси, полученной при аналогичной переработке 157 r лиофилизованных листьев Nicotiana tabacum и все вместе (7,8 г) хроматографируют аа колонке. с 240 г силикагеля KCK

60-100 меш ., 4 колонны = 3,5 см слоя адсорбента = 68 см), очи,щенного от солей железа. Колонну последовательно элюируют смесями этанола с хлороформом, содержащим

0,5, 10,. 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 об.В этанола, а затем этанолом. Объем фракции .каждого состава 1450 мл. Биотест с СЬепород1ою .

rubrum обнаруживает активные вещества во фракции 3; вес сухого вещест ва в ней, 1,53 г.

f0 Активную фракцию хроматографируют на незакрепленном слое силикагеля

КСК (100-150 меш) толщиной 5 мм на пластинках 20 ° 20 см порциями по

0,25 г. Каждую пластинку разделяют на 5 равных по величине Rf зон, одноименные зоны объединяют и элюируют смесью метанола с хлороформом (1г1), а затем метанолом. Элюаты упаривают. Виотест обнаруживает активное.вещество в элюате зоны с

Ry 0,2-0,4. Вес сухого вещества в этом элюате 0,37 г, т.е. в 600 раэ .меньше, чем вес взятых в опыт листьев.