Способ выделения гормона роста человека

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической и медицинской промышленности, и представляет собой способ выделения высокоочищенного препарата гормона роста человека из биомассы клеток E. coli, содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК, полученную методами генной инженерии. Гормон роста человека применяется при лечении карликовости детей и может быть применен при лечении переломов костей и ожогов. Целью изобретения является сокращение времени выделения целевого продукта и увеличение выхода при увеличении и содержания мономерного гормона в препарате. Поставленная цель достигается тем, что бактериальные клетки разрушают под действием щелочи, экстракт хроматографируют на пористом анионообменнике АМ-П, активные фракции высаливают сульфатом аммония, проводят аффинную хроматографию на агарозном сорбенте с иммобилизованным триазиновым красителем, осуществляют гель-хроматографию на сефадексе G-100, активные фракции лиофильно сушат, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой способ выделения гормона роста человека из биомассы микроорганизмов, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК, полученную методами генной инженерии. Целью изобретения является сокращение времени выделения целевого продукта и увеличение выхода при увеличении содержания мономерной формы гормона в препарате. Высокоочищенный препарат гормона роста человека получают из клеток E. coli, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК, по следующей технологической схеме: бактериальные клетки разрушают под действием щелочи; экстракт хроматографируют на макропористом анионообменнике типа АМ-П; активные фракции высаливают сульфатом аммония (60% насыщения), диализуют против фосфатного буфера; проводят аффинную хроматографию на агарозном сорбенте с иммобилизованным триазиновым красителем, концентрирование активных фракций ультрафильтрацией; осуществляют гель-хроматографию на сефадексе G-100; активные фракции лиофильно сушат. Выход мономерного гормона роста человека составляет выше 30% от содержания гормона в клетках. Содержание мономерного гормона роста в препарате не ниже 95% , препарат гомогенен по белку. П р и м е р 1. В. 50 г. клеток E. coli суспендируют в 250 мл 10 мМ калийфосфатного буфера рН 8,0, доводят рН до 10,5 с помощью 0,5 М NaOH, перемешивают в течение 3 ч. Суспензию центрифугируют в течение 60 мин при 14000 об/мин, с помощью 0,5 М HCl доводят рН надосадочной жидкости до 8,0, объем доводят до 400 мл (содержание белка 4 мг/мл) и наносят со скоростью 100 мл/ч на колонку с анионообменником АМ-П (2х25 см), предварительно уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером рН 8,0. Элюцию проводят 100 мМ калийфосфатным буфером рН 8,0 с 1М хлористого натрия. Гормон роста человека анализируют по реакции преципитации с антисывороткой к гормону роста человека. Фракции, содержащие СТГ (V = 400 мл), высаливают сульфатом аммония, постепенно добавляя к раствору 156 г соли, перемешивают в течение 60 мин. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин при 14000 об/мин. Осадок суспендируют в 90 мл 10 мМ калийфосфатного буфера рН 8,0 и диализуют дважды против 3 л того же буфера в течение 12 ч. Отдиализованный раствор гормона (100 мл) со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку с "голубой" сефарозой (0,9 х 16 см), предварительно уравновешенную 10 мМ калийсофатным буфером рН 8,0. Элюцию проводят тем же буфером. Активные фракции (200 мл) концентрируют ультрафильтрацией до объема 15 мл и со скоростью 10 мл/ч наносят на колонку с сефадексом G-100 (2,6 х x100 см), предварительно уравновешенную 50 мМ (NH₄)₂CO₃ рН 8,3. Активные фракции, элюируемые тем же буфером, лиофильно сушат. Б. Концентрацию гормона в растворах определяют методом диффузии в агар с антисывороткой и по диаметру зон преципитации определяют концентрацию гормона. На стеклянную пластинку наносят 1,5 мм слой 1,5% бактоагара, приготовленного на 10 мм Na-фосфатном буфере рН 7,2 и содержащего 40 мг/мл кроличьей сыворотки к человеческому гормону роста. В агаре вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 1-2 см одна от другой. В одну лунку вносят раствор стандартного гормона роста, а в остальные - разные разведения исследуемой жидкости. Разведения готовят так, чтобы концентрации гормона составляли приблизительно от 10 до 100 мкг/мл. В каждую лунку закапывают по 6-10 мкл раствора. Пластинку выдерживают в течение 8 ч во влажной камере при температуре 37^оС. Затем замеряют диаметры зон преципитации и по стандартной кривой (построенной по стандартному препарату гормона) определяют концентрацию гормона в исследуемой жидкости. На стандартной кривой по оси абсцисс откладывают концентрацию гормона в мкг/мл, а по оси ординат квадраты диаметров зон преципитации. Получают 90 мг препарата, содержащего 97% мономерного гормона роста человека. Выход составляет 33% от содержания гормона в биомассе. Даннные по очистке приведены в табл. 1. П р и м е р 2. Очистку ведут по примеру 1, но вместо "голубой" сефарозы используют сорбент, полученный иммобилизацией отечественного активного ярко-красного красителя 5СХ на сефарозе 6В в слабощелочной среде и последующей инкубацией при 45^оС в течение 40 ч. Выход годного препарата составил 32% , содержание мономерного гормона роста в препарате составило 96% (табл. 2). Препараты гормона роста человека, полученные по примеру 2, гомогенны по белку. П р и м е р 3. Очистку ведут по примеру 1, но вместо "голубой" сефарозы используют сорбент, полученный иммобилизацией активного красно-коричневого 4ХК на сефарозе 6В. Выход готового препарата составил 33% . Содержание мономерного гормона роста в препарате составило 96% (табл. 3). (56) Авторское свидетельство СССР N 1538513, кл. C 12 N 15/00, 1985.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА, предусматривающий разрушение суспендированных в буфере клеток бактерий Escherichia coli, осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию, концентрирование ультрафильтрацией, гель-хроматографию на Сефадексе G - 100 и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени выделения и повышения выхода целевого продукта при увеличении содержания мономерной формы гормона в препарате, перед осаждением осуществляют ионообменную хроматографию на анионообменнике АМ-П, а перед гель-хроматографией раствор, содержащий гормон, подвергают аффинной хроматографии на агарозном сорбенте с иммобилизованным триазиновым красителем.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2