Способ получения диагностикума

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУЙА для серологической идентификации коклюшных бактерий путем связывания иммуноглобулинового сенситина с Матрицей на основе полистирола в буферном растворе при рН 7,5-7,7, отличающийся тем, что, с целью повышения серологической активности диагностикума, в качестве матрицы . используют смесь полистиролсульфохлорида и полистирола, обработанного диазометаном, взяток в весовом соотношении 3:1, а в качестве сенситина смесь равных количеств иммуноглобулинов М и из коклюшной агглютинирующей сыворотки и процесс ведут в присутствии 1-2%-ного бычьего альбумина в течение 13,5-14 ч при повьш1ении температуры от 20 до .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

31Я) А 61 К 39/44

Г"

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

\ л

I. ) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3354898/28-13 (22) 31.07.81 (46) 15.09.84. Бюл. ¹ 29 (72) С.Ф.Алимова, В.Н.Милютин, Е.П.Москаленко и Т.А.Славянская

1 (71). Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт и Ростовский

-на-Дону ордена Дружбы народов госуL дарственный медицинский институт (53) 615.373.34(088.8) (56) 1. Кирицева А.Д. Реакция пассив ной гемагглютинации при коклюше.

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1966, № 2, 127.

2. Авторское свидетельство СССР

¹- 544431, кл. А 61 К 39/44, 1975.

3. Dubert S.М., Sezemez P., Ann.

Inst. Pasteur, 1953, 84, 2, 370. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОС ИКУЙА для серологической идентификации коклюшных бактерий путем связывания иммуноглобулинового сенситина с матрицей на основе полистирола в буферном растворе при рН 7,5-7,7, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения серологической активности диагностикума, в качестве матрицы используют смесь полистиролсульфохло. рида и полистирола, обработанного диазометаном, взятых в весовом соотношении 3:1, а в качестве сенситинасмесь равных количеств иммуноглобулиF нов М и 9 из коклюшной агглютинирующей сыворотки и процесс ведут в присутствии 1-2%-ного бычьего альбумина в течение 13,5-14 ч при повьппении температуры от 20 до 34 С.

1040б54 2

Изобретение относится к области медицины, в частности к серологическим методам экспресс-диагностики кок люша.

До сих пор единственным методом ранней диагностики коклюша является бактериологическое исследование. Это объясняется тем, что в катаральный период болезни, который длится 2 недели, отмечается наиболее высокая 1Î высеваемость коклюшных бактерий, и больной в значительной мере опасен из-за отсутствия характерных клинических симптомов. Однако даже при проведении многократнйх бактериоло- 15 гических исследований купировать распространившуюся вспышку весьма затруднительно. Последнее определяется тем, что коклюшная палочка относится к медленно растущим микроорганизмам, 20 ,поэтому результаты посевов становятся известными не ранее чем через 4872 ч после взятия материала. За это время инфицированные дети с еще неразвившимися клиническими симптомами 5 или болеющие легкими и атипичными формами являются источниками распространения инфекции.

Все вышеизложенное свидетельствует о необходимости качественно нового ЗО подхода к решению вопроса ранней лабораторной диагностики коклюша и об актуальности проведенных исследований. Время ответа о наличии возбудителя в материале от больного можно З5 сократить при использовании серологического метода, позволяющего идентифицировать его в короткий срок. Для этой цели могут быть применены эритроцитарные антительные диагностикумы 40 способ получения которых состоит в связывании сенситина — коклюшного гамма-глобулина с эритроцитами Р13.

Выявляемая концентрация коклюшных бактерий в 1,0 мл составляет 8 10 — 45

1,6 IO микробных клеток. Однако

Ь даже при условии подбора оптимальньж, режимов сенсибилизации эритроцитов гамма-глобулином или другим сенситином, разрушающая способность эритро- 59 цитарных препаратов ограничена прежде всего особенностями самого биологического носителя и характером взаимодействия (физико-химическим) между сенситином и матрицей. Кроме того, 55 большое значение имеет качество самих эритроцитов, зависящее от многих условий, таких, как пол, возраст, гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови.

В связи с этим воспроизводиМость результатов может варьироваться, Таким образом, причинами, затрудняющими использование эритроцитарных диагностикумов, являются недостаточная их активность в серологических реакциях, лабильность эритроцитов к воздействию экстремальных факторов, затруднения при стабилизации и стандартизации эритроцитарных препаратов и т.п. Перспективным направлением является создание иммуноглобулинового диагностикума на синтетической основе. Такой подход позволяет повысить активность и специфичность препарата за счет стереокомплементарности гомологических структур — активных центров антител и антигенных детерминант.

Известен способ получения пиагностикумов для серологических реакций на основе синтетических частиц, который заключается в связывании иммуноглобулина против грамотрицательных бактерий с матрицей — полистиролсульфохлоридом в буферном растворе при рН 7,2-8,5 в течение 3 ч при 20 С и 12 ч при 4 С (21.

Диагностикумы используют для серологической идентификации возбудителей особо бпасных инфекций, в том числе и коклюша. Однако получение препаратов по этому способу не обеспечивает достаточной серологической активности при удовлетворительной специфичности препаратов, что снижает чувствительность и усложняет учет реакций. Активность диагностикумов в реакции агломерации изменяется от 10 до 10 -10ч.микробных клеток в 1,0 мл.

При создании коклюшного иммуноглобулинового диагностикума по указанному способу выявилась еще одна особенность — препараты приобретают свойство спонтанно склеиваться.

1Целью изобретения является получение диагностикума для серологической идентификации коклюш:)ых бактерий с повышенной серологической активностью, Поставленная цел достигается способом получения диа ностикума для серологической идентг<>икации коклюшных бактерий путем связывания иммуноглобулинового сенсити .а с матрицей на основе полистирол в буферном растворе при рН 7,5-7,7 в котором в ка1040654 честве матрицы предлагается испольэовать смесь полистиролсульфохлорида . и полистирола, обработанного диазометаном, взятых в весовом соотношении

3:1, а в качестве сенситина — смесь равных количеств иммуноглобулинов и и

2 иэ коклюшной агглютинирующей сыворотки и процесс вести в присутствии !

1-2 -ного бычьего альбумина в течение

13,5-14 ч при повышении температуры 10 от 20 до 34 С.

Введение в матрицу полистирола, обработанного диазометаном, обусловливает цветовой эффект, в результате чего повышается наглядность серологи-15 ческого теста.

Выбранное соотношение между компонентами позволяет более рационально расходовать исходное сырье и обеспечивает эффективность выявления кок- 20 люшных бактерий.

При увеличении кислотности буферного раствора наблюдается хлопковавие антител, а в резко щелочной среде снижается процент связывания сенсити- 25 нов с синтетическим носителем.

В течение 13,5-14 ч происходит максимальное связывание искусственно скомпонованных растворов коклюшных иммуноглобулинов (на 97-987). УвеличеЗ0 ние времени иммобилизации поэтому нерационально. В течение меньшего времени иммобилизации не удается получить высокоактивный диагностический препарат. 35

Температурный режим выбран с учетом особенностей используемых сенситинов. При более высокой температуре происходит самоагрегация иммуноглобчлинов.

Постепенное увеличение температуры при иммобилизации необходимо для наиболее полного связывания иммуноглобулинов M и . Частицы матрицы в присутствии большого количества бел- 45 ков приобретают способность к самоагрегации, в связи с чем возникает необходимость введения стабилизаторов.

Полученный продукт обладает высо- 50 кой сорбционной емкостью. Выявляемая концентрация коклюшных бактерий в исследуемом материале до 1 10" микробных клеток в 1,0 мп.

Пример. 30 мг порошка, 55 состоящего иэ смеси (31.1 по несу сухого компонента) сульфохлоридполистирола и полистирола, обработайного диаэометаном и измельченного до размера частиц 1-8 мкм, смешивают в 10 мл 0,15 М фосфатного буфера с 10 мг иммуноглобулинов М и 1 в присутствии 0,1 г альбумина и 0,02Хного раствора пиридина. Выделение гамма-глобулинов иэ коклюшной агглютинирующей сыворотки проводят с помощью метанола С3 l, разделение имму- . ноглобулинов — на колонке с сефадексом 6-200. Иммуноглобулины M искусственно выделяют из больших количеств агглютинирующей сыворотки и

Ф концентрируют в меньшем объеме, после чего антитела классов М и "У соединяют в равных пропорциях. рН среды строго выдерживают равным 7,6, экспонируют 14 ч, постепенно повышая температуру от 20 до 34 С. Затем трижды по 10 мин отмывают центрифугированием при 3000 об/мин 1,5Х-ным раствором аминокислотного экстракта углеводородных дрожжей БВК. Осадок взвешивают в 1,57-ном растворе того же экстракта и лиофилиэируют.

Методика постановки реакции.

На обезжиренное стекло наносят

О, 1 мл исследуемого материала, добав-. ляют 1 каплю диагностикума. Стекло покачивают в течение i мин, оставляют на горизонтальной поверхности и через 2-5 мин проводят учет. При положительном результате появляется агломерация частиц диагностикума. В отрицательном случае суспензия остается гомогенной.

Испытывают 3 серии диагностикума в 5 повторностях. Диагностикум проверяют в реакции агломерации с гомо-, гетерологичными вэвесями чистых и смешанных культур (соотношение бактерий с гетерокультурой 1:1, 1:19

1:100). Для сравнения используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные иэ тех же серий сывороток, в РНГА. Специфичность реакций подтверждают торможением.

В результате испытаний препараты зарекомендовали себя.как высокоактивные, специфичные, сохраняющие свою первоначальную активность в течение

3 лет.

Предлагаемый способ обеспечивает выявление минимальных количеств коклюшных бактерий как в чистых, так и в смешанных культурах, что особенно важно при исследовании материала от

1040654

Составитель 0. Скородумова

Редактор П. Горькова Техред С.Легеза Корректор С. Шекмар.Заказ 7494/1

Тираж 687

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 а

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород. ул. Проектная. 4 больных. Новый способ экономически выгоден, поскольку значительно сокраЩает время исследования. Кроме того, быстрое выявление боЛьных обеспечивает своевременную .изоляцию их и прерывает дальнейшее распространение инфекционного начала среди детского контингента.