Способ получения трипептидов

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИ Х

РЕСПУБЛИИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

Ый4М1Л.:6 ««, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2940703/23-04 (22) 26.06.80 (31) R1-718 (32) 28. 06. 79 (33) BHP (46) 07. 04. 84. Бюл. Р 13 (72) Лайош Кишфалуди, Тамаш Сиртеш, Лайош Балашпири, Ева Палоши, Ласло апории и Адам Шаркади (BHP) (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр

РТ (ВНР) (53) 547. 964. 4. 07 (088. 8) (56) 1. Боданский N., Клаузнер Я.С.

Активированные эфиры и стратегия пептидного синтеза.-В сб.: Химия полипептидов. Под ред. П.Кацояниса.

М., "Мир", 1977, с. 30. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПЕПТИДОВ общей формулы

Х-У-И- ИН2, где Х вЂ” L-пироглутамил, )7 -пироглутамил, (, -б-кетопипеколил,(-кетоимидазолидин-4-карбонил, Ь -тиаэолидин-4-карбонил;

У вЂ” (, -норвалил, Ь,-лейцил; — L -пролил, D -пролил, li -иэолейцил, (-гомопролил, Ь -пипеколил, L -тиаэолидин-4-карбонил, э а к л ю ч а ю шийся в том, что амид аминокислоты общей формулы

9(5П С 07 С 103/52 A 61 К 37 02

Н-W- NH

2 где W имеет указанные эначения, ацилируют пентафторфениловым эфиром М-трет-бутилоксикарбониламинокислоты общей формулы

Вос-У-ОР1

Р> где Вос — трет-бутилоксикарбонил;

Pfp — пентафторфенил; у имеет указанные значения, иэ полученного защищенного дипептида общей формулы

Вос-У-W- NH 2, где Вос, У и W имеют указанные значения, путем ацилолиза получают свободный дипептид общей формулы

Н-У-Щ-НН2, где У,и W имеют указанные значения, который ацилируют пентафторфениловым эфиром Й -карбобензоксиаминокислоты общей формулы

Q -Х-OPf p 1 где Š— бенэилоксикарбонил; X u P имеют указанные значения, до пслучения защищенного трипептида общей формулы

z -Х-у-vl- НМ2 где 7,Х, У и W имеют укаэанные значения, из которого путем каталитического гидрирования удаляют К -концевую защитную группу.

) ()8,50 5

Изобретение относится к способу получения новых трипептидон — биологически активных соединений, которые могут найти применение н медицине.

В пептидной химии широко используют способ получения пептидов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты с помощью активированных эфирон Ч -защищенных аминокислот, например, пентафторфениловых эфиров j1) .

Цель изобретения — получение новых трипептидов, обладающих ценными фармакологическими свойстнами. 15

Поставленная цель достигается способом получения трипептидов общей формулы

Х-У-1111- МН2 (<) где Х вЂ” L -пироглутамил, D -пироглута- ?0 мил, L -б-кетопипеколил, 1кетоимидазолидин-4-карбонил, 1,-тиазолидин-4-карбонил;

У вЂ” 1, -норвалил, (-лейцил;

\Я вЂ” L -пролил, 1) -epoxy L -изолейци, L -гомопролил, L -пипеколил, ). -тиазолидин-4-карбонил, заключающимся в том, что амид аминокислоты общей Формулы

Н-W-НН2, (ц)

30 где W — имеет указанные значения ацилируют пентафторфениловым эфиром

11-трет бутилоксикарбониламинокислоты общей формулы

Вос-У-0P f р, (1») 35 где Вос — трет бутилоксикарбонил;

Pfp — пентафторфенил;

У вЂ” имеет указанные значения, из полученного защищенного дипептида общей формулы:

Вос-У- Yl- NH2 (1Ч)

1 где Вос, У и %I — имеют указанные значения, путем ацилолиза получают свободный дипептид общей .формулы 45

Н-У-W- NH

2 (v) где У и Ф вЂ” имеют укаэанные значения, который ацилируют пентафторфенилоным эфиром N -бензилоксикарбониламинокислоты общей формулы

Z -Х-ОР, (Ч) где Х вЂ” бензилоксикарбонил; Х и Р имеют указанные значения, до получения защищенного трипептида общей формулы

g -Х-V-a- NH 2 (ЧП) где 7.,Х, У и Ъ имеют указанные значения, из которого путем каталитического гидриронания удаляют К -концевую за- 60

,итную группу.

В примерах, поясняющих практическое выполнение предлагаемого способа получения трипептидов, использованы следующие сокращения: 65

HPro — L -гомопролин;

К1с — Ь -2-кетоимидазолидин-4карбоновая кислота;

Kpc — L --б-кетолиперидин-2-карбоновая кислота.

Г

Р1р — .пипеколиновая кислота;

Тса. — L -тиазолидин-4-карбоновая кислота:

ДЦГК вЂ” дициклогексилкарбодиимид;

ДЦН вЂ” дициклогексилмочевина;

Р1 р-ОН вЂ” пентафторфенол; д11ФА — диметилформамид.

Оптическое вращение измеряют с помощью поляриметра "Нетkin-Flmez 141".

Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках "Kieselgel G nach

t,ahl фирмы " 1exck" ФРГ н следующих системах растворителей:

1. Хлороформ:метанол — 9:1.

2. Этилацетат:(пиридин:уксусная кислота: вода — 20:б:11) — 95 5.

3. Этилацетат:(пиридин:уксусная кислота: вода — 20:б:11) — 9:1.

4. Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота: вода — 20:6:11) — 8:2.

5. Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота: вода — 20:б:11) -3:2. б. Этилацетат: (пиридин:уксусная кислота:нода — 20:б:11) — 2:3.

Пятна на хроматограммах детектируют с помощью раствора нингидрина с последующим ныдержинанием в течение 5 мин при 105 С г. раствором а толидин-йодистый калий после предварительной обработки газообразным хлором.

Очистку конечных соединений осуществляют с помощью колоночной хроматографии с использованием н качестве сорбента "Силикагеля б" Фирмы

"Mesck" (ФРГ) с величиной частиц

0,062 — 0,2 нм.

Пример 1. Амид Ь -пироглутамил-1 -лейцил-Ь-пипеколиновой кислоты.

Стадия 1 Хлоргидрат амида L -лейцил- .-пипеколиновой кислоты.

1,54 г (12 юдоль) Н-Р1 р-NH< суспендируют в 20 мл ДМФА, добавляют

5,16 г (13 ммоль) Вос-LeuQPf ð, 1,68 мл (1? ммоль) триэтиламина при перемешивании. Полученный раствор упаривают н вакууме и полученное в остатке масло растворяют в

60 мл хлороформа. Раствор смешивают с 0,2 мл 2-(диметиламино) -этиламина, через 5 мин проьывают 1 н. раствором соляной кислоты (3 раза по

20 мл), 1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 20 мл) и водой (3 раза по 20 мл), сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают.

Остаток растворяют в 3 мл этилацетата и смешивают раствор с 10 мл

5 н. раствора соляной кислоты в этилацетате. Через 1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром, выпавший осадсе

1085505

45 отфильтровывают и сушат в вакууме над безводным сульфатом натрия.

В итоге получают 3,12 г (94%)

Н вЂ” L,åè-piP-NH2801. Hf,=0 46 (5) .

Аминокислотный анализ. С Lu 0,95 (1 0 ; Leu 1 0 (1 О); Pj р 0 95 (1 О) 5

Элементный анализ.

Рассчитано,Ъ: С 15,90; H 8,01;

)f15,90.

С Н О) N< (мол .вес 352,44)

Найдено,%: С 57,77; Н 8,20;

N 15,83.

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-L ïèðîãëóòàìèë-).-лейцил-L-пипеколиновой кислоты..

3,13 г (11,2 ммоль| Н-Leu-Р1р-NH< 15 и 4,94 r (11, 5 ммоль) g -С1р-Opf p растворяют в 35 мл ДНФА и раствор смешивают с 1,57 мл (11,2 ммоль} триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добавляют 1,57 мл (11,2 ммоль) триэтиламина, перемешивают в течение 20 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в

50 мл хлороформа и раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты 25 (2 раза по 30 мл), 1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 30 мл} и 30 мл воды. Органическую фазу высушйвают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Аморфный остаток переме- 3О шивают с холодным эфиром, эфир декантируют и оставшееся масло вносят в н-гексан до затвердения. Полученный таким образом аморфный продукт (4,7 г) кристаллизуют из смеси этил- 35 ацетат — эфир. Получают 3,32 г (61%)

2-Cfp-Leu-.Ð р-NH2. T.пл. 143-144 С, Rf =О, 51 (4), (сс) =-97, 2 С=1, ACOH)

Элементный анализ

Рассчитано,Ъ: С 61,71, Н 7,04;

) 11,51.

С2,Н Of,Nq (мол.вес 486,.57)

Найдено, Ъ: С 61,67, H 7,05; и 11,40.

Стадия 3. Амид Ь -пироглутамил-4. лейцил-L-пипеколиновой кислоты.

2,1 г (4,32 ммоль) Е -С1р-Leu-P pNH2 растворяют в 40 мл метанола, добавляют 0,2 r 10%-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора и пропускают в реакционную смесь газообразный водород в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растирают с эфиром. Полученный таким образом сырой продукт (1,48 г) растворяют в 2 мл воды, осветляют активированным углем и отфильтровывают. В фильтрате раст- 60 воряют 4 r хлористого натрия и раствор промывают хлороформом (3 раза по 10 мл). Органическую фазу высушивают над безводным сульфатом натрия, унаривают и аморфный оса- 65 док растирают со смесью этилацетата и эфира. В итоге, получают 1,33 г (87,5%) CO p-Leu-Р р-КН . Rf =0,60 (5), (Я=-86,4" (С=1. АсОН) .

Элементный анализ.

Рассчитано,Ъ: С 57,94, Н 8,01, tJ 15,90.

С Н К<О< (1ол.вес 352,44)

Найдено,Ъ: С 57,77, Н,8,20

И 15,83.

Аминокислотный анализ. СЕи 0,95 (,0) L e0 1,0 (1,0) Pj ð 0,95 (1,0).

Пример 2. Амид L -пироглутамил-L — лейцил-L.-тиазолидин-4-карбОнОВОй кислОты.

Стадия 1. Хлоргидрат амида — лейцил-L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты.

1,81 r (11 ммоль) Н-Tca-NH HCP cyc2 пендируют в 30 мл ДМФА и смешивают с 3, 97 r (10 ммоль) Вос-L е -ОР4р, 1, 4 9 г (11 ммоль) 1-окси-бен зтриазола и 1,22 мл (11 ммоль) М -метилморфолина. Полученный раствор отстаивают в течение ночи при комнатной темпетратуре, затем упаривают в вакууме и остаток растворяют в 80 мп хлороформа. Раствор промывают 1 н.. раствором соляной кислоты (3 раза по 20 мл), 1 н. раствором карбоната натрия (3 раза по 20 мл) и 10 мл воды, .высушивают над безводным.сульфатом натрия и упаривают в вакууме.

Хлопьевидный аморфный остаток растворяют в 5 мл этилацетата, смешивают с 10 мл 7 н. раствора соляной кислоты и этилацетата. Через 1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром полученный осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме над безвадной гидроокисью натрия. В итоге получают 1,84 r (65%) Н-Leu-Tca-MH x х НСС. В =0,25 (5), T.пл. 170-174 С (разл) .

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонилL -пироглутамил-L-лейцил-L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты.

1,69 r (6: моль)Н-),eu-Тса-КН2-НС1 суспендируют в 20 мл ДМФА и смешивают с 2,7 r (6,3 ммоль) Z -С р-OPf p и О, 84 мл (6 ммоль1 триэтиламина.

Смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа и раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (3 раза по 10 мл, 1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 10 мл) и 10 мл воды. Органическую фазу упаривают, остаток растирают с эфиром и полученный сирой продукт очищают многократным осаждением из смеси этилацетат — эфир..Получают

1,64 г (56%) z -CR p-L eu-ЙН . T.ïë.

108-1100C, Qf =0,46 (4), (J =-130, 30 (C=1 AcOH).

108" 505

Стадия 3. Амид 1,-пироглутамил Iå0öèë-4 — тиа олидин-4-карбоновой кислоты, 1,62 г (3, 3 ммоль) g - СРр-Leu-TcaNH< растворяют н 6 мп охлажденного льдом 3,5 н. раствора бромистого водорода н ледяной уксусной кислоте. Раствор отстаивают в течение

1,5 ч при 0 — 5 C. Затем реакционную смесь разбавляют эфиром, верхнюю фазу декантируют и оставшееся масло растворяют в 20 мл воды.

Водный раствор нейтрализуют твердым бикарбонатом натрия и экстрагируют эфиром (3 раза по 10 мл) . Водную фазу упаривают в вакууме, оста- 15 ток растворяют в 20 мл хлороформа, раствор высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают. Аморфный остаток растирают с эфиром и высушивают. Полученный сырой продукт 70 (1,13 г) растворяют в злюируюшей жидкости (4 ), нводят в колонку, заполненную 20 г силикагеля. Колонку элюируют той же самой смесью растворителей. Из фракции, содержащей сырой продукт, выделяют 0,78 r аморфного продукта. Этот продукт растворяют н 20 мл воды, раствор осветляют актинированным углем и лиофилизуют. Получают 0,62 r CE pLeu-Tca-NH (53% от теории) . Р =

=О, 53 (5), (сс) =-145, 0 (С=1, Ac0H) .

Аминокислотный анализ. СЕв 0,94 (1,0); Le 0 1,0 (1,0) .

Il р и м е р 3. Амид L -пироглу- 35 т амил- (. -л ей цил-3-проли на .

Стадия 1. Хлоргидрат амида: лейцил-2-пролина.

0,91 r (8 ммоль) Н-Э-Pro -ЙН и 3,2 r (8 ммоль) Вос-Lee-Opf р растворяют 40 в 30 мп ДМФА, смешивают с 1,12 мл (8 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь выдерживают в течение ночи и затем упаривают. Остаток растворяют н 60 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (2 раза по 20 мп), 1 н. раствором гидроокиси натрия (3 раза по 20 мп) и 20 мп воды, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают.

Остаток растворяют в 5 мп-этилацетата, смешивают с 7 мл 4 н. раствора хлористого водорода в этилацетате. Реакционную смесь через 1 ч разбавляют эфиром, образовавшийся осадок отфильтровывают и сушат в вакууме нац безводной гидроокисью натрия. В итоге получают 1,54 г (73%) Н-Leu -Рг о-NH

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-Ь-пироглутамил-L-лейцил-D-про- 60 лина.

1,54 r (5,8 ммоль) Н-1,ец- -Ред

-ЦЙ2 НСС растворяют в 20 мп ДМФА, смешивают с 0 81 мп (5 ° 8 ммоль) триэтиламина и 2,58 r (6 ммоль) 65

-Ct. р-OPfp. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добанляют 0,81 мл (5,8 ммоль) триэтитамина, перемеши вают 10 мин и упаринают н вакууме.

Остаток растворяют в 60 мп хлороформа, растнор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (3 раза по 15 мп

1 н. раствором гидроокиси натрия (3 раза по 15 мп) и 15 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Аморфн и остаток растирают с эфиром. Полученный сырой продукт(2,1 r) перекристаллизовынают из 5 мл этилацетата. В итоге получают 1,8 r (66%) Š— Ир-Le@-2Рго -МН . Т.пл. 153-157 С, И=0,38 (4),(eLj =-24,5ОС (С=1, АсОН) .

Стадия 3. Амид L --пироглутамилL -лейцил- О-пролин.

1,5 r (3,25 ммоль) — С(р-Leu-2-Р о—

) Н растворяют н 70 мл метанола, раствор смешивают с 0,3 r 10 t-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора и пропускают через раствор водород н течение 1 ч, отфильтровывают катализатор, фильтрат упаринают и аморфный остаток смешивают с эфиром.

Полученный сырой продукт 0,94 r растворяют в воде, раствор осветляют активированным углем и отфильтровывают, филътрат лиофилизуют. Получают 0,87 г (79М CP. p-Leu-2-Р о Н . P=O,47 (5f;(a) =+8,4 (C=1, AcOH)

Аминокислотный анализ. CCQ1g02 (1,0), L еи 1,0 (1,0), Рго 0,96 (1,0).

Пример 4. Амид -пироглутамил-L -норвалил-L -изолейцина.

Стадия 1. Амид трет-бутилоксикарбонил-L-норналил-L-изолейцина.

3,7 г (19 ммоль) Н- )Pe-NH

Остаток растворяют в 100 мп хлороформа, растнор промывают с 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза по 20 мп), 1 н. раствором карбоната натрия (2 раза по 20 мл) и 20 мп ноды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Кристаллический остаток растворяют с эфиром и высушивают. В итоге получают 4,7 г (83%) Boc-Nva-3

194ОС, 9 =0,60 (2),(сс) =-43,7 (C=1, метанол).

Стадия 2. Хлоргидрат амида L -норналил-L-изолейцина.

4,5 r (13,7 ммоль) Boc-Nva-М е-ЙН суспендируют в 20 мл зтилацетата и смешивают с 12 мл 6 н. раствора соляной кислоты н этилацетате, через

1 ч разбавляют эфиром, осадок от1 OR.>505 деляют фильтрованием и .ырой продукт (3,6 г) перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира. Получают

3, 5 r (96%) Н-Nvi - З е- КН . HCt .

Т.пл. 254-255 С, Н1=0,45 (5), ,Д =+3,8 (С=1, метанол) .

Стадия 3. Амид бензилоксикарбонил-Ь-пироглутамил-L-норвалил-),изолейцина, 3,3 г (12,4 ммоль) Н- Nva- )6e-КН НС3 растворяют в 40 мл ДИФА. К раствору 10 при перемешивании добавляют 1,74 мл (12,4 ммоль) триэтиламида и 5,85 r (13,6 ммоль) g — Ct.р-ОР(p ° Через 5 мин добавляют 1,74 мл (12,4 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь раз- 15 бавляют эфиром, перемешивают, оставляют стоять в течение 2 ч в холодильнике и затем отфильтровывают.

В итоге получают 5,11 r (86%) Г. — C"рМч а-Эр е-КН .T. Ïë. 252-253 С, R< =0,60 20 (4)";/g) =-57,5 (C=1, AcOH).

Стадия 4. Амид L --пироглутамил-L— норвалил-L-изолейцина.

4,75 г (10 ммоль) Z -Ctp-Nva-3KeNHg растворяют в 200 мл уксусной кислоты и после добавления 1 г 10%ного палладия на активированном угле в качестве катализатора в течение 1 ч пропускают через раствор газообразный водород. По окончании гидрирования катализатор отделяют фильтрованием, фильтрат упаривают и остаток растирают с эфиром. Получают

3,34 г (98%)СРр-И а-Зе-NH I(98% от теории) . T.ïë . 267-270 (разл .), R(=0,61 (5);$gjв =-50,2 (C=1, АсОН).

Аминокислотный анализ. СВи 0,94 (1,0); К v а 1.,0 (1,0), 3R е 1,05 (1,0).

Элементный анализ.

Рассчитано,%: С 56,45, Н 8,29,"

К 16,46. 40

С 6 Н Е8 04 К4 (моль. вес 340,43)

Найдено,%: С 56,56; Н 8,37, К 16,28.

Пример 5. Амид Ь -тиазолидин-4-карбонил-Ь-лейцил-Ь-пролина ..45

Стадия 1. Хлоргидрат амида L -лейцил-L-пролина.

,28 г (20 ммоль) Н-Р о-КН,> и 3,97 г (10 ммоль) Вос-Leh-ОР(р растворяют . в 40 мл ДМФА и через 5 мин раствор упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 80 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (3 раза по 20 мл), 1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 20 мл) 55 и 20 мя воды, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают.

Остаток растворяют в 5 мл этилацетата, раствор смешивают с 10 мп

5 н. раствора хлористого водорода 60 в этилацетате. Через 50 мин реакцйонную смесь разбавляют с эфиром, образовавшийся осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над безводной гидроокисью натрия. В итоге по- 65 лучвют 2,42 г (91 «) H-L с и — пг <>-+II

>.НСИ /=0,20 (1:>

Стадйя 2. Амид ти >волидин-4-карбонил-L-лейцил — -пролива.

5,13 r (22 ммодь) Вос Тса ОН и 4,0 > (22 ммоль) PjpOH растворяют в 60 мп этилацетата и раствор при охпаждении льдом и перемешинании смешивают с

4,12 г (20 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0-5 " С, затем отфильтровывают

ДЦМ, фильтрат и остаток растворяют в 50 мп 3 -гексана. Раствор промывают 1 н. раствором бикарбоната натрия (5 раз по 25 мл)и 25 мп воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученное таким образом 7,32 г Вос-Тса-ОР1р растворяют в 20 мп ДМФА и раствор добавляют к суспензии 5,23 r (20 ммоль) H-Leu — P> o- NH„ ° HCp в 30 мл

ДМФА. Затем эту сМесь охлаждают льдом и при перемешивании добавляют

2,8 r (20 ммоль) триэтиламина. Через 5 мин добавляют 2,8 (20 ммоль) триэтиламина, перемешивают 20 мин и упаривают в вакууме. Полученное в остатке масло растворяют в 100 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (3 раза по 30 мп)

1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 30 мл) и 30 мл воды, су- . шат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученный в остатке

8,84 г Вос-Тса — Leu-Р о-КНд растворяют в 15 мп этилацетата, раствор смешивают с 15 мл 6 н. раствора соляной кислоты в этилацетате и через 1 ч разбавляют этилацетатом.

Полученный осадок растирают, отфильтровывают и высушивают в вакууме над безводным едким натром.

Таким образом получают 8,05 г сырого продукта, который растворяют в

80 мл воды, раствор экстрагируют эфиром (3 раза по 20 мл), затем значения рН водного раствора устанавливают на значении 8 и раствор экстрагируют хлороформом (3 раза по 20 мп). Объединенные экстракты хлороформа высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растнрают с эфиром и высушивают.

В итоге получают 5,20 r (76%) Н-Тса-.

),ец-Р о-NH> . Т.пл. 159-1СА С, Й = а

=0,63 (5) («) =-162,9 (C=1, AcOH).

Аминокислотный анализ. Leu1, 0

1,0), Рро 0,95 (1,0).

Элементный анализ.

Рассчитано,%: С 52,61; Н 7,65;

16,36; N 9,36.

С Н2ьО К4 (мол..вес 342,46) .

Найдейо,%: С 52,45; Н 8,03;

16,51, N 9,59.

Пример 6. Амид 1-2-кетоимидазолидин-4-карбонил-ь-лейцил-)— пролина.

1085505

Стадия 1. Пентафторфениловый эфир бензилоксикарбонил-L-2-кетоимидазолидин-4-карбоновой кислоты.

10,56 r (40 ммоль) Z -К1 с-ОН и 9,09 r (44 ммоль) Р» р-ОН растворяют в смеси 100 мл (1:2) смеси ДМСА и диоксана (1:2). Рставор при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 9,06 г (44 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают при 0,5 С в течение 1,5 ч, затем отфильтровывают ДЦМ, фильтрат упаривают и полученное в остатке масло смешивают в )р -гексаном для кристаллизации.

Полученный сырой продукт (16,46 r) перекристаллизовывают из 50 мл этилацетата. Получают 12,75 г (74%)2,—

К с-ОР1р. Т.пл. 146-148 С, 9=0,53 (1), (g) =-42,1 (C=1, этилацетат) .

Элементный анализ.

Рассчитано,Ъ: С 50,25, Н 2,58, Я 6,51, F 22,08

С а Н1„Fg N Os (мол. вес 430,29)

Найдено,Ъ: С 49,88, Н 2,35, Н 6,66; F 21,81.

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-L — 2-кетоимидазолидин-4-карбонил-L-лейцил-L-пролина.

2,38 г (9 ммоль) Н-(.еК-Pr î-NH< ° HCF суспендируют в 30 мл ДМФА и смешивают с 3,87 г (9 ммоль), -К(с-ОРтри 1,26 мл (9 ммоль) триэтиламина, перемешивают 5 мин и добавляют

1,26 мл(9 ммоль) триэтиламина, перемешивают 20 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза по 10 мл), 1 н. раствором карбоната натрия (2 раза по 10 мл), 10 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Получен-:- ное в остатке масло вносят в эфир для кристаллизации и отфильтровывают. Полученный сырой продукт (3,31 г) кипятят в 30 мл этилацетата. После охлаждения суспензию оставляют стоять в течение нескольких часов в холодильнике и отфильтровывают.

Получают 3,0 r (70%) Z -К1c-Leo-P o (Н, Т.пл . 172-174 С; РГО 18 4 .(сС) =-102,6О (C=1, Ac0H }.

Элементный анализ.

Рассчитано, %: С 58,34, Н 6,60, И 14,79.

Cg> Н >< О g> (мол. вес 473, 50 )

Найдейо, Ъ: С 57,52, Н 6,62, и 14,62.

Стадия 3. Амид Ь -2-кетоимидазо,лидин-4-карбонил-1-лейцил-Ь-пролина.

1,2 r (2, 4 ммоль g -К с-),ец-Р оЯН растворяют в 30 мл воды, раствор смешивают с 0,25 г 10%-ного палладия на активированном угле в качестве катализатора и пропускают через смесь в течение 4 ч газообразный водород. Затем катализатор отфиль I0

30 тровывают, фильтрат и аморфный остаток высушивают в вакууме над

Р О . Полученный продукт (0,75 г) растворяют в воде, раствор осветляют активированным углем и лиофилизуют. В итоге получают 0,61 r (71%)

Kq c-Leg — Р о-МЯ2,, >I=0,35 (5)

i<) 5=. 98, 4 (C=1,ÀñÎÍ }.

Аминокислотный анализ . (, ец 1, О (1, 0), Рро 0,96 (1, 0).

lI р и м е р 7. Амид Ь -6-кетопи- пеколил-L -лей цйл-L -пролина.

Стадия 1. Пентафторфениловый эфир -б-кетопипеколил карбоновой кислоты.

4, 3 r (30 ммоль) L -6 — кетопипеколиновой кислоты и 6, 07 г (33 ммоль)

Pf p-ОН растворяют в 100 мл хлороформа и раствор при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с

6,8 г(33 ммоль) ДЦГК. Смесь перемешивают в течение 1 ч при О С, зао тем оставляют стоять на ночь в холодильнике. На следующий день выпавшую ДЦМ отфильтровывают, фильтрат упаривают и кристаллический остаток растирают с k -гексаном. Полученный сырой продукт (9,87 r) растворяют в 20 MJI этилацетата, раствор оставляют стоять в течение 1 ч в холодильнике, затем осветляют активированным углем, Отфильтровывают и упаривают. Полученное в остатке масло растворяют в смеси 5 мл этилацетата и 20 мл М -гексана, раствор оставляют на ночь в холодильнике и на следующий день выпавшие кристаллы отделяют фильтрованием. Получают 6,34 (68,5Ъ) Крс-OPfр. Т.пл. 96-98 С, (о 1 =-30,0 @ (С=1, этилацетат ) .

- Элементный анализ.

Рассчитано, Ъ: С 46,6 2, Н 2,6 1

4,53, F 30,72. (< Н8О НГ (мол.вес 309,20)

Найдено, Ъ: С 46,37, Н 2,88, Й 4,26, 30,51.

Стадия 2. Амиг L -б-кетопипеколил(, -лейцил-L-пролина.

1,32 r (5 ммоль) Н-(.ец-Р о-NH< HCR суспендируют в 20 мл и при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 1,61 г (5,2 ммоль}) Крс-ОРГР и

0,7 (5 ммоль1 триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добавляют 0,7 мл (5 ммоль) триэтиламина, перемешивают еще 20 мин и упаривают в вакууме. Кристаллический остаток растирают с эфиром, кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и хлороформом и высушивают. В итоге получают 1,27 г (723) Kpc-Le@ -Pwo-ИН . Т.пл. 214216 С, К1=0,41 (5),() =-83 (C=1,Ac0H).

Аминокислотный анализ . L -Амино-адипиновая кислота 0,99 (1,0), L em 1,00 (1,0) р Pro 0,98 (1,0).

1085505

Пример 8. Амид L — 6-кетопипеколил-(,-норвалил-L-пролина.

Стадия 1. Хлоргидрат амида L -норвалил-L-пролина.

2,2 г (20 ммоль) H-Pro- )Н1 и 3,83 г (10 ммоль) Вос-1ч à-Opf р растворяют в 40 мл ДМФА, выдерживают 5 мин и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. соляной кислотой (3 раза по 10 мп), 1 н. раствором бикарбоната натрия (3 раза по 10 мп)

10 мп воды, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растворяют в 10 мп этилацетата, смешивают с 10 мп 5 н. раствора хлористого водорода в этилацетате.

Через 30 мин реакционную смесь разбавляют эфиром, выпавший осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над едким натром. В итоге получают

1,83 г (73%) Н-Nva-Pro-NH НС1.

Rf=0,10 (4), Стадия 2. Амид L --б-кетопипеколил

L-норвалил-(.-пролина.

2,38 г (9,5 ммоль) Н-)Va-PIIо-ЙН :НС суспендируют в 30 мй и при охлаждении льдом и перемешивании смешивают с 30,09 г (10 ммоль) Крс-ОР(р и 1,33 мп (9,5 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают

5 мин, добавляют 1,33 (9,5 ммоль) триэтиламина,перемешивают еще 20 мин и уларивают в вакууме. Кристалличес-" кий остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают на фильтре этанолом и высушивают. Полученный сырой продукт 3,66 г растворяют в воде, раствор осветляют активирован- ным углем и упаривают, кристаллический остаток растирают с 10 мп этанола. Смесь оставляют в холодильнике и затем отфильтровывают. Получают 2,10 г (65%) Kpc-Leu-Pro-NHq<

Т.пл .. 192-193 С, Rp0,31 (5); с ) >=

=-83, 2 (C= 1, AcOH ) °

Аминокислотный анализ. L -Аминоадипиновая кислота 1,02 (1,0} Кча 1,0 (1,0) Pro 0,97 (1,0) .

Элементный анализ °

Рассчитано,%: С 56,78, Н 7,74, Й 16,56.

С 6 Н26 М404 (мол.вес 338,40)

Найдено,%: С 56,55, Н 8,00, М 16,37.

Пример 9.. Амид) -пироглутамил-Ь-лейцил- L-пролина.

Стадия 1. Пентафторфениловый эфир бензилоксикарбонил-D-пироглутаминовой кислоты.

4,55г (18 ммоль) Z -Э- L

50 мп этилацетата и раствор при перемешивании и охлаждении льдом смешивают с 4,12 г (20 ммоль) ДЦГК.

Реакционную смесь перемешивают, 1 ч при О С, затем отфильтровывают ДЦМ, фнльтрат упаряBBY)т, в Н вЂ” гексая для кристалли-i.ции.

Полученный сырой продукт (7,3 г} растворяют в 20 мл этилацетата, раствор оставляют в течение 1 ч в холодильнике. затем осветляют активированным углем и упаривают. Полученное в остатке масло растворяют в 5 мп этилацетата и добавлением

20 мп Н -гексана осаждают продукт.

10 Получают 6,60 r (85%)i -Э вЂ” CHp-OPfp.

Т.пл. 81-82 С, Rf =0,84 .(1);ф), = — -40,1 (C=1, этилацетат

Элементный анализ.

Рассчитано,%: С 53,16 Н 2,82, 15 N 3,26, F 22,13.

С,) Н12 О NF g (мол.вес 429,30)

Найдено, %: С 53, 28, H 3, 04, 1 3,02, F 21,86.

Стадия 2. Амид бензилоксикарбонил-2-пироглутамил-Ь-лейцил-L-пролина.

3,24 г (12,3 ммоль) Н-(,eu-Р1 о-NH HCf суспендируют в 50 мп ДМФА и при охлаждении льдом и перемешивании

25 смешива1от с 5,6 r (13 ммоль) 7 -DCE р-ОР р и 1,72 мл (12,3 ммоль) триэтиламина. Реакц.сонную смесь перемешивают 5 мин, добавляют 1,72 мл .(12,3 ммоль) триэтиламина, переме30 шивают 20 мин и упаривают в вакууме.

Остаток растворяют в 120 мл хлоро° форма, раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза по

30 мл), 1 н. раствором карбоната на- трия (,3 раза по 30 мп) и 30 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток вносят в эфир для кристаллизации. Полученный TSKHM образом сырой продукт (5,31 r)кипятят с 50 мп этилацета40 та, полученную суспензию оставляют стоять 3 ч в холодильнике и выпавший в осадок продукт отделяют фильтрованием. Получают 4,61.г (80%)

Х -1)- С8р-Leg-Pr о-Мнд Т.пл. 189-194 C i

45 g<=.0,44 (4); (<) =-31,2С1 (C=1,АсОН) .

Стадия 3. Амйд L -пироглутамиллейцил-L-пролина.

4,48 г (9,5 ммоль) 7, -3- CCp-LeII-Рго)4Н растворяют в 200 метанола и раст50.âîð смешивают с катализатором—

0,9 г 10%-ного палладия на активированном угле и через смесь пропускают в течение 1 ч газообразный водород. Затем катализатор отфильтро55 вывают, фильтрат упаривают, остаток растирают с эфиром. Полученный .продукт(3,07 г) растворяют в воде, раствор осветляют активированным . углем и лиофилизуюz. В итоге получают 2,90 r (90,5%) D -ССр-Leu-PIoЯН, Rf=0,40 (5),(aL) =-23, 6 (C=1, Ac0H).

Аминокислотный анализ. Glu 0,93 (1,0); Ьеи 1,0 (1,0); Pro 0,98(1,0).

Пример !О. Амид), -6 — кето— пиперидин — 2-карбснил-), — норвалил-L— гомопролина.

Стадия 1. Амид трет-бутилоксикарбонил-L-гомспролина.

?,29 г (10 ммоль) Вос-HPF o-OH растворяют в 30 мл этилацетата, раствор смешивают с 1,4 мл (10 ммоль триэтиламина, охлаждают до -10 С и по каплям добавляют 1,3 мл (10 ммоль) изобутилового эфира хлор- 10 угольной кислоты. После перемешинания н течение 15 мин при-10 С в о течение 0,5 ч пропускают через реакционную смесь газообразный аммиак, оставляют на 2 ч при 0 — 5"C. )5

Осадок затем отфильтровывают, фильт— рат упаривают и полученное в остатке масло растворяют в 30 мл хлороформа. Раствор промывают 1 н. соляной кислотой (2 раза по 10 мл), 1 н. раствором гидрокарбоната натрия (2 раза по 10 мл) и 10 мл воды, высушивают над безводным сульфатом натрия, упаривают и полученное в огтатке масло вносят в Н -гексан для 25 кристаллизации. Полученный таким об— разом сырой продукт (1,95 r)перекрис— таллизовывают из смеси этилацетата и эфира. Получают 1,78 г (78%) ВосНРго-NH7. Т. пл. 138 †1 С, Р,1=- 3п

=0,43 I 2),(),=-24,85 (C=1, АсОН ) .

Стадия 2. Хлоргидрат амида L— гомопролина.

1,6 r (7 ммоль) Вос-HPI.o-NH растворяют в 10 мл этилацетата и смешивают с 10 мл б н. раствора хлористого водорода в этилацетате. Через

1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром, осадок растирают с эфиром и отфильтровывают.

В итоге получают 1,05 г (91%) Н-; 4О

НРто-))Н HCE. Т. пл. 178-180 С, P(=0,32 (6), () =+26,2 (C=-1, метанол1 .

Стадия 3 . Хлоргидрат амида L— норвалил-) -гомопролина.

0,99 г (б ммоль) H-HPIo-МН HCP. суспендируют в 20 мл ДМФА и при перемешивании добавляют 0,84 мл (б ммсль) триэтиламина и 2,3 г (б ммоль) Вос

Nv а-ОР» р. Через 15 мин добавляют

0,84 мл (6 ммоль) триэтиламина, перемешивают 1 ч и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа, раствор промывают 1 н. раствором соляной кислоты, 1 н. раствором гидрокарбоната натрия (2 раза по 10 мл), высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученное в остатке масло растворяют в 6 мл этилацетата 60 и смешивают с 10 мл б н. раствора соляной кислоты в этилацетате, через 1 ч реакционную смесь разбавляют эфиром, аморфный осадок растирают и высушивают в вакууме над безВсдне 1м «дким нсrтpof1. П иToF E. пcH1, чают 1, 2? г (89, 5 ) Ii — Мча-Нрt c-NFl7 H(Р й» =-0,12 (5) .

Стадия 4. Амид -б-кетспиперидин-2-карбонил-).-нсрвалип †), — гсмопр лин -..

1, 22 г (,37 ммоль) H — )Ivy — HPt"с— Ч!7 HC Р pacтвсряют в Z 0 мл ДЕФА у смешивают с 0, 75 мл (5, 37 ммоль) тризтиламина и 1, 7 г (5, 5 ммоль )

Êðñ-ОРГР. Реакционную смесь перемешивают 5 мин, добавлHKT 0,75 мл (5,37 ммоль) триэтиламина, перемешивают 20 мин и упаринают в вакууме, Остаток растирают с эфиром и полученный аморфный сырой продукт 1,8 г наносят на колонку, приготовленную из 40 г силикагеля„ и элюируют смесью растворителей (4) . Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и упаривают. Получают 1,11 г чистого продукта, котсрый растворяют н воде, осветляют актиниронанным углем и лиофилизуют.В итоге получают Крс- FIva-НРго-N 87 (53% от теории) . B,» — — 0,35 (,5);() > =-44,6" (C=1, А. ОН).

Фармакологическая активность трипептидов, полученных предлагаемым способом, изучена с помощью приведенных биологических тестов 1 — 6.

1. Торможение галоперидоловой каталепсии у крыс..Жинотным подкожно вводят 40 мг/кг галоперидола 4и -хлорфенил) — 1-3 †(I1 -фторбензсил)— пропил-пиперидин-4-ола и через

120 мин контролируют наступление каталепсии. Затем крыс разбивают на группы по 10 животных и внутривенно вводят дозами ТРГ-СРр-H s—

PIo-ХН и описываемые трипептиды.

Животным контрольной группы вводят физиологический раствор поваренной соли. Через 15, 10, 90, 120 мин после обработки испытывали действие по увеличению каталепсии отдельных соединений, животные считались каталептическими, если их передние лапы, установленные на столбике высотой 7 см, не могли координиронать свою позицию в течение 30 с.

Из числа животных, не показавших каталепсии, путем проббитанализа определяли соответствующее E17 — значение для отдельных эффективных веществ.

Опыты проводили с мужскими особями крыс, имеющими вес 160 — 180 г.

2. Потенциирование локомоторной активности мышей, вызнанной с помощью

),-допа.

Животным внутрибрюшинно вводят в дозе 40 мг/кг и -метил-й-пропаргилбензиламина (паргилин), а затем

20 мг/кг ТРГ или описываемого трипептида, подлежащего исследованию, и,наконец, 100 мг/кг ) -допа. Через

1 5

1085 »05

РГейтвие

79 2,7

23,5 60 319 80 127 36,3 24,5 32,0 33,9 37

Kpc- Leu- Pro

Крс-Nva-Pro

Glp-Leu-Tca

10,6 30 36 45

31,4 120 171 142

65 63,3 23,9 33,1 32,5 51

52 36,2 24,9 33,1 32,2 39

7,2

112 36,4 24,6 30Ä7 31,0 38

108 36,3 20,7 26,5 32,2 76

201 89

63 30

38, 5 120

35,3 15

Glp- Leu-P ip

Крс-Nva-HPro

70 15 54 58 115 36,5 ?7,4 25,8 25,6 97

D-61р-Ьeu-Pro

28,8 59

30,2 56

27 .7

98 35,5 24,1

80 30 118 70

Kic-Leu-Pro

100

35,5

80 15 100 100 100 36 с2 25 9

ТР1

П и м е ч а н и е. Время гвксобарбитального сна:,(X+E) 38,4<1,36 мин, Р время этанольного сна: (Х Е) 46,> 2,17 мин. лф

30, 60 и 90 мин после указанной обработки была измерена локомоторная активность животных. Установленные значения приведены в таблице в процентах, считая на значения, полученные с животными, обработанными ТРГ.

Для этих опытов используют по 15 мышей-самцов весом 18-22 г.

З.Резерпино-гипотермическое возвратное действие на мышей.

Мышей-самцов весом 18-22 г, разделяют на группы по 10 животных, внутрибрюшинно вводят резерпином дозами

5 мг/кг. Через 16 ч животным вводят дозами по 20 мг/кг ТРГ или трипептида, подлежащего исследованию.

Измеряют ректальную температуру животных перед обработкой резерпином (в таблице: "норм."), через

16 ч после обработки резерпином (в таблице: "рез.") и через 1 или

2 ч после введения исследуемого трипептида (в таблице "после обработки") . .В таблице указаны средние значения ректальной температуры, измеренной у групп по 10 мышей.

4. Влияние на продолжительность сна, вызванного гексобарбиталом.

Мышам-самцам, разделенным на группы по 10 животных, внутривенно вводят по 60 мг/кг гексобарбитала натрия, через 10 мин после этого животным внутрибрюшинно вводят дозаt ми по 20 мг/кг веса ТРГ или исследуемый трипептид, подлежащий исследованию. Время сна указано в таблице в процентах, считая на значения, измереннье у животных контрольной группы (средние значения для групп по 10 животных).

5. Этанольный наркоз, Мышам смешанного пола весом по 1822 г, разделенным на группы по 20 животных, вводят внутрибрюшинно по 4,5 этанола. Через 10 мин после этого животным вводят внутрибрю 0 шинно в дозе 20 мг/кг исследуемый

4 трипептид. Время "íà в таблице указано в процентах (среднее значение гчя группы по 20 животных), считая на значения, измеренные у животных

15 контрольной группы. б. Гормональная активность (ТРГдействие) у крыс.

Крысам-самцам (Ristar) с весом около 200 г, разделенным на группы по 7-8 животных, вводят внутривенно дозами по 20 мг/кг ТРГ или исследуемый трипептид. ТРГ-реакцию животных определяют через 15 мин после введения ТРГ или исследуемого трипептида иэ плазмы животного,в результате радиоиммунного исследования.

Относительная эффективность рассчитана по методу четырех пунктов, при этом эффективность ТРГ принимали

100.

Средние значения биологической эффективности соединений общей формулы (1), определенные в результате описанных фармакологических методов представлены в таблице.

18

1085505

Составитель О.Галкин

Техред А.Бабинец

Редактор Н.Джуган

Корректор О. Билак

Заказ 2047/56 Тираж 410

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент"., г. Ужгород, ул. Проектная,4

Иэ данных таблицы видно, что описываемые аналоги ТРГ обладают эна чительным действием на центральную нервную систему. С этой точки зрения особенно преимущественными являются такие производные, у которых в положении 2 ТРГ-молекулы стоит алифатическая аминокислота с прямолинейной или разветвленной углеродной цепью. Предпочтительными являются с точки зрения этого действия также такие аналоги ТРГ, у которых в положении 1 находится 6-кетопипе колиновая кислота. у этих производных гормональное действие ТРГ либо полностью отсутствует, либо воспроизводится до минимума, причем одновременно оказываемое на центральную нервную систему действие увеличивается существенно, в некоторых случаях даже в

8 раз.