Способ получения полипептидов
0 Il И C A H H E (и,,980615
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
Н ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 08. 12. 78 (23) 2700902/23-04 (5lj М. Кл. (23) Приоритет - (32) 08. 12. 77
С 07 С 103/52
А 61 К 37/02
1осудеретеенный квинтет
СССР по делам нэобретеннй н еткрытий (31) 858496 (33} Сщд
Опубликовано07. 12. 82. Бюллетень ¹ 45 (53} УДК547 964. .4.07(088.8 ) Дата опубликования описания 07. 12.82,72) Автор изобретения
Иностранец
Гидеон Гольдстейн
Иностранная фирма
"Орто фармасьютикал Корпорейшн". (США) <71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ
Изобретение относится к способу получения новых полипептидов — биологическиактивных соединений, которые могут быть применены в медицине.
Известен метод твердофаэного синтеза, который широко используют в химии пептидов. Сущность метода состоит в присоединении С-концевой аминокислоты, синтезируемой пептидной цепик твердому полимеру ковалентной связью и последовательном присоединении остальных аминокислот ступенчато (одна за другой ) пока не будет "собрана" .вся необходимая аминокислотная последовательность (1 ).
Известен также метод, при котором синтезированный пептид .удаляют с полимерной подложки и отщепляют оставшиеся защитные группы. Метод позволяет в процессе синтеза удалять побочные продукты, избыток реагентов фильтрованием и отмывкой. В качестве носителя используют различные нерастворимые полимеры, содержащие в своей структуре- функциональные группы, при2 годные для ковалентного присоединения первой защищенной аминокислоты, такие . .как целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, сульфированный полистирол, хлорметилированный сополимер стирала и дивинилбензола, бензгидриламинная смола и т.п.. Не вступающие в реакцию функциональные группы аминокислот, из которых строится
1р пептидная цепь, блокируют, используя обычно применяемые в пептидной химии защитные группы, например третбутилоксикарбонильная, бенэилоксикарбонильная, бенэильная и т. и.. Деблокироватб ние защитных групп конечной пептидной цепи осуществляют обычно с помощью от.носительно мягкой обработки защищенного пептида кислотой (например, три" фторуксусной ). Использование известер ных методов синтеза позволяет получить полипептид, обладающий своеобразными фармакологическими свойствами (21.
Цель изобретения - получение ново, ro полипептида.
3 980615
Поставленная цель достигается способом получения полипептидов общей формулы
X- Lys — у - Gln — R, (1 ) где Х: Sz„, 1 А1а, ОА1а;
ЕГс СО с
R: Н, СН СО, С Н заключающийся в том, что замещенный по аминогруппе L-глутамин присоединяют к нерастворимой полимерной смоле ковалентной связью предпочтительно в среде абсолютного этанола при +80 G; удаляют с -аминозащитную группу от глутамина обработкой продукта присо- 35 единения аминокислота-полимерная смола трифторуксусной кислотой, деблокированную аминогруппу L-глутамина подвергают. взаимодействию с Y-аминокислотой, защищенной по Ы-аминогруппе, 20 используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления о -аминозащитной группы обработкой трифторуксусной кислотой, продукт вводят во взаимодействие с L-лизином, защищенным по
d-аминогоуппе,.предпочтительно используя карбодиимидный метод, полученную защищенную no d-аминогруппе трипептидполимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и три- зо пептид-полимерную смолу конденсируют с N- R-замещенной с X-аминокислотой; защищенной по ee d-аминогруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, обработкой полученного продук- з
t та кислотой, если R-0H, или аммиаком с в диметилформамиде, если R-NH< отщепляют пептидную цепь от смолы и защищенный пептид деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой, и в случае 4О использования бензгидриламиновой смолы (R-NH ) независимо от обработки ! продукта кислотой или аммиаком.
Предпочтительным вариантом способа является использование в качестве полимерной смолы хлорметилированного полистиролдивинилбензола и бензгидриламиновой смолы.
Пример 1. При получении полипептида используют о-нитрофенидовый эфир N-третбутилоксикарбонил-L-глутамина, М-третбутилоксикарбонил-N-2е
-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, й-третбутилоксикарбонил-О- бензил-L-серин, N-третбутилоксикарбонил-L-аланин >>
Ы
В этих реагентах третбутилоксикарбонильная группа в дальнейшем будет обозначаться сокращенно как ВОС-груп4 па. Реагенты для определения аминокислотной последовательности марки."Секвенал" ("Sequenal"), а именно: дициклогексилкарбодиимид, флуорескамин и смола для твердофазного синтеза. Смола, использованная для синтеза, представляла собой хлорметилированную полистирол-дивинилбензольную смолу в виде гранул размером 200-400 меш, содержащую 1Ф дивинилбензола и 0,75 ммоль хлора на грамм смолы. Для получения полипептида 2 ммоль с -80С-L-глутамина этерифицируют 2 ммоль хлорметилированной смолы в среде абсолютного спирта, содержащего 1 ммоль триэтиламинг, в
О течение 24 ч при 80 С. Полученную смолу, содержащую остато! ВОС-глутамина, присоединенный к ней сложноэфирной связью, отделяют фильтрованием, промывают абсолютным спиртом и сушат до постоянного веса. Затем аналогичным образом присоединяют другие о -ВОС"аминокислоты„ которые сочетают с деблокированной oL-аминогруппой на конце пептидной цепи, связанной с полимерной подложкой (смолой ), в надлежащей последовательности, используя в качестве конденсирующеro (сочетающего ) реагента эквивалентное количество дициклогексилкарбодиимида. 8 реI зультате этой последовательности реакций был получен полипептид формулы (l), причем после каждой реакции сочетания отбирают аликвоту смолы, которую анализируют с помощью флуорескамина на полноту протекания реакции и, если при этом обнаруживают положительную флуоресценцию, что свидетельствует о неполном сочетании, то реакцию сочетания повторяют с той же сс -защищенной аминокислотой. 8 результате нескольких таких сочетаний получают промежуточный продукт - смолу., содержащую защищенный тетрапептид. Эту пептидсодержащую смолу расщепляют с одновременным удалением защитных групп в аппарате "Ке1-Р, используя безводный фтористый водород при ООС в течение 60 мин,в присутствии 1,2 мл анизола на грамм пептидсодержащей смолы.
Реакционную смесь, содержащую пептидный продукт, промывают безводным диэтиловым эфиром и экстрагируют водной .кислотой. Полученный экстракт лиофилизируют и высушенный таким образом пептид хроматографируют на Био-Геле P-6 в 1 N уксусной кислоте. Полученный полипептид имеет 983-ную степень чис5 9806 тоты, характеризуется аминокислотной последовательностью
Н - Аlа - Lys - Ser — Glu - ОН
Для идентификации используют тонкослойную хроматографию и электрофо- 5 рез, при которой тонкослойную хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (силикагель компании
Бринкман с флуоресцентным индикатором) толщиной 0,1 мм. Пластинки разме10 ром 20 20 см. Хроматографирование проводят с использованием 30 мкг образца исследуемого пептидного продукта и следующих элементов
Rf н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода = 30: 15: 3: 12
R f этилацетат: пиридин: уксусная:: кислота:вода = 5:5:1:3
R f этилацетат:н-бутанол:уксусная кислота: вода = 1: 1: 1: 1. 20
Элект роферетическое исследование проводят на образце весом 100 мкг с использованием 3-миллиметровой Ватмановской бумаги (11,5х56,5 см) и пиридин-ацетатного буферного раствора с рН 5,6. Электрофорез осуществляют при
Пример, N R X Y
0-Аl а
МН2
Sar
Sar
Sar
0-Аla 0-Аlа
D-Ala Sar
Sar 2-Ne А1а
Н, Sar
Sar
IVg
6064 (производства фирмы Истмен Кодак, размером 20 20 см) и использованием в качестве элюента системы растворй"
2 телей н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода в отношении 15:10:3:12 (Rg)
Электрофорез проводят на образцах весом 50 мкг, которые наносят на бумагу Ватман И 3 (размер листа 5,7 < з55 см ), используя пиридин-ацетатный буферный раствор и разность потенциалов между электродами 1000 В; электрофорез в этих условиях продолжают в течение 1 ч. Для опрыскивания тонкослойных хроматограмм и электрофоретограмм с целью проявления пятен испольДля идентификации и доказательства гомогенности полученных пептидов использованы тонкослойная хроматография и электрофорез, которые проводят следующим образом: для тонкослойной хроматографии использованы образцы продуктов весом 20 мкг, хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (Кизельгель фирмы Керк, ФРГ, размер пластинок 5 20 см), используя в качестве элюента систему растворителей: н-бутанол-уксусная кис55 лота - этилацетат-вода в объемном отношении 1: 1: 1: 1, а также на пластинках с тонким слоем целлюлозы марки
15 6 найряжении 1000 В в течение одного часа. Для опрыскивания тонкослойных хроматографических пластинок и элект рофореграмм используют реагент Паули и раствор нингидрина. В итоге получают следующие результаты: !К = вещество осталось на старте, R вещество осталось на старте и Rf 0,336.Элект > f рофорез в указанных условиях приводит к перемещению вещества на 9„4 см по направлению к катоду.
Пример ы !!-IV .
Используя способ, аналогичный вышеописанному, для получения замещен" ных полипептидов, синтезирован ряд полипептидов общей формулы
° 1
R- X- Lys -Y- G!u" R
Эти пептиды получают твердофазным, методом, с использованием в качестве твердой полимерной подложки бензгидриламинной смолы.
Результаты получения этих пептидов представлены в табл, 1.
Табли.ца
7 980615 8 зуют реагент Паули и раствор нингид- ществ при электрофорезе приведены отрина. носительно тех же величин для эталонРезультаты получения представлены ного пептида Н-Arg-Lys-Asp-Val-Тугв табф. 2 (величины Rf и пробег ве- -ОН ).
Таблица 2
Электрофорез
Пример, h
Ниграция продуктов
Степень чистоты продуктов, ф
0,44
0,68 2,07
0,60 1,78
0,,71 2,10
0,88
98
0,56
СН СО - Sar - Lys - Sar - Gln QH
8 результате использования аналогичных методик тонкослойной хроматографии и электрофореза для исследования пептидного соединения, полученного в примере IV было показано, что для него свойственны следующие характеристики: R =(О, 155 ), К вещество остается .на старте, R = 0,265; при
1 элвктрофорезе в указанных выше условиях вещество перемещается от старта на расстояние 13,1 см по направлению к катоду.
Пример V . Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, полученные, какописано в примерах 1 и 11, ацилируют уксусным ангидридом в соответствующих условиях, после чего удаляют защитные группы и отщепляют полимерную подложку. В итоге получают следующие ацилированные производные
СНЭСО - Ala — Lys - Ser - Gln - ОН
Пример VI Защищенные тетрапептидные смолы, полученные,как описано в при" мерах I u I l,переэтерифицируют сметилатом натрия в метиловом спирте в условиях, О обеспечивающих протекание реакции переэтерификации, приводящей к отщеплению пептидных продуктов от полимерной подложки. Последующее удаление защитных групп от полученных продуктов пе- ы реэтерификации приводит к получению этерифицированных пептидных производных, соответствующих формулам
Н вЂ” Ala - Lys - Ser - GInOCH>
Н вЂ” Sar - Lys - Sar — Gl nOCH
Э
Пример Ч1 I . Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, и полученные, как описано в примерах 1 и II<, подвергают обработке диэтиламином с целью отщепления защищениых пептидов от твердой полимерной подложки в условиях, обычных для проведения реакций такого рода. Последующее удаление защитных групп приводит к получению следующих диэтиламидных производных указанных пептидов
Н - Ala — Lys - Sar - Gl n.-Н (С Я )
Н - Sar - Lys - Sar= Уп -Н(С Н <)>
П р и м e p VIII Используя методы
) описанные в примерах I и Il, но замещая И-концевые остатки зланийа и серина этильными группами, на заключительном. этапе пептидного синтеза вместо защищенных аланина и сарколизина в реакцию сочетания вводят эквивалентные количества соответствующим образом защищенных й-Ы-этил-L-аланина или
Й-с(-этил-сарколизина, в результате чего получают следующие й-этилированные пептиды
И
С Я - А!а - Lys - 1ег - Gln - ОЯ .
С Н - Sar - Lys - Sar - Gln - ОН.
Пример IX. Открепление защищенных тетрапептидов, полученных в примере Vill от смолы с использованием раствора аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакции амидирования, с последующим
9 980615
Продолжение табл. 3
Ql y
XIV
Ы у-С1у
XV-I
XVII
XVIII
XIX
С1п G1у-GIy
Gln Gly-Gly-Ser
Sar Qly
Sa r . Q l y-G I y
ХХ
XXI
XX I I
Sar G l y-G I y-Ser
XX I I 1
2$
ХХ1Ч
Анализируя полученные пептидные продукты методами тонкослойной хромаЗО тографии и электрофореза, при использовании соответствующих методик, описанных к примере I для соединений, описанных в примерах Х1 и Х1I
Полученные результаты представле э ны в табл. 4.
Таблица 3
ОН
Яп
XI I
0Н
Таблица4
Е
Пример
Электрофорез ,Ииграция по напрвлению к катоду, см
На старте На старте 0,303
7,4
8,3
X I I
На старте На старте 0,186 г формула изобретения . Способ. получения полипептидов об,щей формулы
R -Х- Lys -Y - Gln -R, ss где Х " Sar, L-Аlа, 0 Ala;
Y - Ser, 5аг, D-A I a, 2MeAIa; .
R - Н, СН,СО, С,Н, Р - ОЙ, W,, I
1 удалением защитных групп приводит к получению амидов соответствующих N- этилированных пептидов
С(Н - Ala - Lys - Ser - Gl и - йН 2.
С Н -. Sar - Lys - Sar - Gln - ННд
П р и и е. р Х. Защищенные ацетилированные тетрапептидные смолы, полученные в примере V, подвергают обработке раствором аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакций амидирования, и после удаления защитных групп получают следующие амиды пептидов
СН>СО -, Ala - Lys - Ser -: Gln - МН
СН СО - Sar - Lys - Sar - Gln - NH<
Э
IT р и м е р ы ХI-XXVI При использовании совокупности реакций и методов, описанных выше, для удлинения пептидной цепи, получены следующие полипептиды, замещенные по, концевым амико- и карбоксильным группам радикалами R и R
Р- Аlа - Lys - Ser - Gln - R >
I где R u R обозначают заместители при аминокислотных остатках, приведенные в табл. 3.
Используя методики проведения тон, кослойной хроматографии и электрофореза, описанные в примерах 1I и III для соединения примера XXII получены т следующие характеристики: Р =0,23, R< 0,25, электрофоретическая миграцйя (перемещение ) по направлению к катоду = 0,88.
Н, Glу-Glу-Ser .
Н G1у-G1у" Ser-Asn
Gln Gly
Sar : Gly-61у-Ser-Asn
G In Gly"Q1 y-Ser-Asn
Составитель В. Волкова
Редактор М. Товтин Техред М.Кощтура Корректор Н. f Заказ 9395/50 Тираж 445 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по -делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 11 980615 отличающийся тем, что замещенный по аминогруппе 1 -глутамин присоединяют к нерастворимой полимерной смоле ковалентной связью предпочтительно в среде абсолютного этанола при +80 С, удаляют а -аминозащитную группу oT L-глутамина обработкой про.дукта присоединения аминокислота-полимерная смола трифторуксусной кислотой, деблокированную аминогруппу L- 10 глутамина подвергают взаимодействию с У-аминокислотой, защищенной по с4аминогруппе, используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления с -аминозащитной группы обработкой трифторуксусной кислотой, продукт вводят во взаимодействие с L-лизином, защищенным по d,-аминогруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, полученную защищенную по о -амино-20 группе трипептид- полимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и трипептид-полимерную смолу конденсируют с М-R-замещенной Хаминокислотой, защищенной по ее о -ами- ногруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод; обработкой полученного продукта кислотой, если R-OH, или аммиаком в диметилформамиде, если R - NH, отщепляют пептидную цепь ! от смолы и деблокируют защищенный пептид обработкой трифторуксусной кисло- той и в случае использования бензгидриламиновой смолы { R - -NH>) независимо от обработки продукта кислотой или аммиаком. 2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве. полимерной смолы используют хлорметилированный полистирол дивинилбенэола и бензгидриламиновую смолу. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Шредер Э., Любке К.Пептиды. Ч. I, М., "Мир", 196/, с. 398. Z. Ногiki К., igano К., inonye К. Symthes s оФ the Herrifiе1d Res n esters of N-protected amino acids with the aid оФ Hydrogen bouding. Chem. Letters, 1978, с. 165.