Штамм @ -59-продуцент гидролазы @ - @ -амино- @ - капролактама и @ -лизинамида

 

Штамм Cryptococcus sp.-59 (коллекция Центрального музея музея промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ У-359) продуцент гидролазы L-o -амино-Е-капролактама и L-лизинамида.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) А

3(5l) С 12 N 15/00

CFCC@gp g

БАТЕЙ ура техйн г;„1,- 13

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И QTHPblTHA (21) 3582134/28-13 (22) 19.04.83 (46) 07.08.84. Бюл. № 29 (72) Б.П. Старкувене, А.К. Вайткявичус, Д.А. Казлаускас и П.Ю. Гальвидис (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 577.15(088.8) (56) 1. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. M., "Наука", 1979, с. 202.

2. Патент Великобритании № 1334970, кл. С 2 С, опублик. 1970. (54) IIITAMM CRYPTOCOCCUS SP.-59 — ПРОДУЦЕНТ ГИДРОЛАЗЫ L с -АМИНО-с-KAIIPOJIAKTAMA И 1. -ЛИЗИНАЬПЩА. (57) Штамм Cryptococcus sp.. — 59 (коллекция Центрального музея музея промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ У-359) продуцент гидролазы L 4 амино-с-капролактама и Ь-лизинамида.

1106835

Изобретение относится к микробиопогической промышленности, в частности к получению нового штамма — продуцента гидролазы Ь-с1-амино- -капролактама и L-лизинамида, который может быть использован для получения L-лизина.

Известна способность дрожжей продуцировать гидролитическне ферменты (1. 3.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является штамм Cryptococcus laurentii IFO 0906 (2 ).

Однако известный штамм гидролизует до L-лизина только L-cl-амино-Е-капролактам.

Целью изобретения является получение нового штамма — продуцента не только L-oL-амино-E-капролактамазы, но и L --лиэинамидазы с высокой активностью

Поставленная цель достигается с

I помощью штамма Cryptococcus sp. — 59— продуцента гидролазы L-eL-амино-Е-капролактама и L-лизинамида, выделенного из почвы, отобранного на территории Литовской ССР и идентифицированного в лаборатории генетики и селекции промышленных микроорганизмов

ВНИИ прикладной энзимологии. Новый штамм хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером ЦИПМ У-359.

Морфологические признаки штамма 35

Cryptococcus sp.-59: клетки овальные, при выращивании глубинным способом образует псевдомицелий. Размер отдельных клеток 3-5х6-12 мкм. Образует колонии складчатой формы белого цве- 40 та, край колонии волнистый, поверхность блестящая, профиль выпуклый, диаметр колонии 5-7 мм (после двухсуточной инкубации).

Физиологические свойства штамма

Cryptococcus sp. — 59: рост на мясопептонном агаре умеренный, на питательном агаре — обильныи, мясопептонную желатину не разжижает, молоко не свертывает, крахмалоподобные соединения не образует, нитраты ассимилирует.

При 37 С растет слабо, оптимальная темпетатура 30 С. В качестве источника углерода для роста усваивает глю55 козу, лактоэу, галактоэу, сахарозу, ксилоэу, рамнозу, глицерин, этанол.

Растет на средах, содержащих в качестве единственного источника азота

L-ot-амино-f-капролактам, и не растет на средах с Il -с(-амино-g-капролактамом.

В качестве индуктора биосинтеза

L-a-амино-5-капролактамазы и L-лизинамидазы использует L-Ы-амино-Е-капролактам или 1 -лизинамид. Культура может храниться в лиофилизированном состоянии.

П р и и е р. Для оживления штамм

Cryptococcus sp. — 59 засевают на агариэованную среду следующего состава, г/л: глюкоза 20; L-о -амино-Е-капролактам гидрохлорид 10; нитрат аммония 5; калий фосфорнокислый однозамещенный 1; магний сернокислый .0,5; марганец хлористый 0,2; дрожжевой экстракт 0,7; рН среды 7,0 (доводят с 10 -ным едким натром), температура культивирования 30 С. Двухсуточную культуру употребляют для получения инокулятора, который выращивают в течение 18 ч в колбах на качалке (200 об/мин) при 30 С на среде описанного выше состава, но с содержанием L- -амино-f-капролактама гидрохлорида 5 г/л. Среду того же состава употребляют и для глубинного выращивания биомассы продуцента в колбах и в ферментере. Вносимое количество инокулята 3-57 от объема среды.

Культивирование в колбах проводят в сосудах объемом 750 мл с 100 мл среды на качалке с 200 об/мин, а культивирование в ферментере типа

Биолафит-20 с рабочим объемом 10 л— при аэрации 8 л/мин и перемешивании

300 об/мин. На 18-ом часу роста клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 4000 я, промывают дважды водой и высушивают путем лиофилизации.

L --о(-Амино-f-капролактамазную активность определяют по скорости образования лизина, измеряемого методом

M. Patthy (А. Patthy, Acta Biochim, Biophys. Acad. Sci. Hung., 1975, vol; 1О, Р 4, р. 277). В плотно закрываемую пробирку с микромешалкой и точно взвешенным количеством (обычно

0,01 г) сухих клеток добавляют 1,0мл

0,1 M раствора L-К-амико-Е-капролактама (рН 8,00) и инкубируют при 50 С.

В моменты времени t„ и t (обычно после 10 и 50 мин от начала инкубирования) отбирают пробы по 10 мкл и их наносят на хроматографическую бумагу для высушивания. Для определения образовавшегося в ходе ферментативной реакции лизина, зоны вырезают, нсрс3 1 068 носят в пробирки с 1,0 мл фурфуроль= ного реагента (9Х-ный раствор фурфурола в смеси ледяной уксусной кислоты и изопропанола 8:3 с добавлением

1 мгlмл пиросульфита калия) и нагревают при 95 С 30 мин. К красноокрашенному раствору добавляют 3,0 мл холодной воды и измеряют оптическую плотность при длине волны 535 нм на спектрофотометре СФ-26. 1„ -о -Амино-с- 10

-капролактамазную активность вычисляют по формуле

dD а.1000

А — — — — — — — —, (tZ t1) Е с

15 где А —. активность,Е/г (мкмоль мин- г g а — разбавление реакционной пробы (в условиях описанной методики равно 400); л0 — изменение оптической плотности 20 анализируемых растворов, взятых в период времени 2 41 — молярный коэффициент экстинкции продукта реакции фурфурола с лизином, численно равный 25

11650 М 1см1; с — концентрация клеток в инкубацггонной среде, г/мл.

L-Лизинамидазную активность клеток определяют по скорости образова- .30 ния аммиака, измеряемого ионселективным электродом типа ЭСЛ-91-07 при помощи иономера И-120. Калибровку электрода осуществляют измерением потенциала V относительно хлорсеребряного электрода известных (О, 1-0,0001 М). концентраций хлористого аммония при о рН 8,0 и температуре 50 С. Калибровочг ную прямую получают в виде 18(ИН =

=а + ЬЧ. Для определения ферментатив-40 ной активности в пробирке с магнитной мешалкой инкубировали точно взвешенное количество клеток (обычно 0,02 г) с 4,0 мл 0,1 М раствора L --лизинамида (рН 8,0) при 50 С. В пробирку

35 4 помещают ионселективный аммониевый электрод и электрод сравнения и измеряют потенциал электрода в моменты времени t, и tz (обычно 10 и 40 мин от начала инкубпрования). L -Лизинамидазную активность вычисляют по формуле сг1Ь Ч2 a4- bV

А (1.0 — 10 " ) 10

m ht ° V где А — .активность, Е/г;

Ч,, Ч - потенциал электрода в моменты времени t1 и tz i MBis а, Ь вЂ” коэффициенты калибровочной кривой (в условиях определения равные — 0,20 и — 0,26 соответственно);

dt - Q — t,ìèí;

m — - масса сухих клеток, г;

V — объем инкубационного раствора, мп.

В таблице приведены данные о гидролитической активности нового штамма

Cryptococcus sp.-59 и прототипа Cryptococcus laurentii IF0 0906.

Из приведенных данных видно, что предлагаемый штамм Cryptococcus зр.-59 гидролизует не только LM-амино-с-капролактам, но и 4-лизинамид, кроме того он способен более эффективно гидролизовать L-с(.-амико-Е,-капролактам: при культивировании в колбах ферментативная активность на 42Х, а при выращивании в ферментере — íà 58Х выше известного штамма.

Данные штамма Cryptococcus sp. — 59 позволяют его применить в производстве лизина; введение стадии ферментативного стереоселективного гидролиза в химический процесс получения этой аминокислоты из смеси DL-k-амино-с-капролактама и DL-лизинамида может уменьшить себестоимость продукта.

1106835

Активность, Е/г (50 С) Штамм

Количество опытов

Способ культивирования

L-oL-Амино-

L-Лизинамидазная капролактамаэная

Cryptococcus sp. — 59

Cryptococcus laurentii

IF0 0906

322

В колбах

Значение получено пересчетом активности известного штамма в единице Е/г.

Составитель Е. Воробьева

Редактор Г. Волкова Техред Л.Коцюбняк Корректор Д. Мельниченко

Заказ 5724/20

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

В колбах 10

В ферментере 3

460+40

510+43

680+52

765+60