Способ хранения спермы осетровых рыб

 

1. СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ОСЕТРОВЩ РУБ, предусматривающий разлив спермы в сосуды и. выдерживание ее в термостате при температуре 1-10°С, о т л и ч а ю щ и и.с я .тем, что, с целью сохранения оплодотворяющей способности спермы, посI леднюю разбавляют защитным раствором в соотношении 1:1, полученйую смесь разливают в сосуды слоем 2-10 мм, а в процессе выдерживания через термостат продувают воздух со скоростью 0,004-0,4 объема камера в 1ч. . 2. Способ по п.1, отличающийся тем., что защитный раствор содержит воду, трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2, моногидрофосфат натрия , глюкозу, бычий сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов, мае.4: Трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,5 Моногидрофосфат 0,5 -3,0 натрия Гидрокарбонат 0,3 -2,0 натрия 0,3 -3,6 Глюкоза Бычий сывороточный альбумин 0,005-0,1 Стрептомицина 0,001 -0,01 сульфат Вода Остальное

(19) . (0) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(5Р А 01 K 61/00

0,001 -0,01

Остальное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3415620/28-13 (22) 31.03.82 (46) 07.12.84. Бюл. 9 45

:(72) Н.С.Пушкарь, С.В.Блохин, Е.Ф.Копейка и A.Ë.Êîìëåâ (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН Украинской ССР (53) 639 .3.034(088.8) .(56) 1, Персов Г.М. Некоторые данные по выживаемости спермиев севрюги (Acipenser-stellatus, Ь.). дАН СССР, 1941, 33, Р 4, с.327-329.

2. Черфас Б.Л. Рыбоводство в естественных водоемах. М., Пищепромиздат, 1956, с.114-115. (54)(57) 1. СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ

OCETPOBHX РЫБ, предусматривающий разлив спермы в сосуды и, выдерживание ее в термостате при температу- ре 1-10 С, о т л и ч а ю щ и й, с я ,тем, что, с целью сохранения оплодотворяющей способности спермы, пос,леднюю разбавляют защитным раствором в соотношении 1:1, полученную смесь разливают в сосуды слоем

2-10 мм, а в процессе выдерживания через термостат продувают воздух со скоростью 0,004-0,4 объема камеры в

1 ч.

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что защитный раствор содержит воду, трис-цитратный буфер рН 7,9.-8,2, моногидрофосфат натрия,.глюкозу, бычий сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.В:

Трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,5

Моногидрофосфат натрия 0,5 -3,0

Гидрокарбонат натрия 0,3 -2,0

Глюкоза 0,3 -3,6

Бычий сывороточный альбумин 0,005 -0,1

Стрептомицина сульфат

Вода

1127554

Изобретение относится к рыбоводству и может быть использовано для искусственного разведения осетровых рыб (белуги, севрюги, стерляди, осетра и др.).

Известен способ хранения спермы осетровых рыб, при котором сперму хранят на льду при температуре

1-3 С Ц.

Однако данный способ позволяет сохранить сперму незначительное вре- 10 мя, при этом ее оплодотворяющая способность снижается с первых суток хранения.

Наиболее близким к изобретению является способ хранения спермы осет-15 ровых рыб, предусматривающий разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при 1-100С I2j . Однако известный способ не обес- Я печивает сохранение оплодотворяющей способности спермы.

Цель изобретения — сохранение оплодотворяющей способности спермы.

Поставленная цель достигается 25 тем, что согласно способу хранения спермы осетровых рыб, предусматривающему разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при температуре 1-10 С, сперму разбавляют защитным раствОром в соотношении 1:1, полученную смесь разливают в сосуды слоем 2-10 мм, а в процессе выдерживания через термостат продувают воздух со скоростью

0,004-0,4 объема камеры в 1 ч.

0 3-2,0

0,3-3,6

Кроме того, целесообразно включить в защитный раствор воду, трис.цитратный буфер рН 7,9-8,2, моногидрофосфат натрия, глюкозу, бычий 40 сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.Ъ рис цитратный . 45 буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,.5

Моногидрофосфат натрия О, 5-3,.0

Гидрокарбонат натрия

Глюкоза

Бычий сывороточный альбумин 0,005-0,1

Стрептомицина сульфат 0 001-0,01

Вода Остальное Ээ

Способ осуществляется следующим образом.

Сперму .охлаждают до 1-10 С со скоростью 4-6 /мин и смешивают 1:1 с защитным раствором, имеющим такую же 60 температуру. Раствор готовят на речной воде. Сперму, смешанную .с раствором, разливают в плоские сосуды слоем 2-10 мм и устанавливают в термостат с температурой 1-10 С. Тер- ;у

0,3-2,0

0,3-3,6

Широкий предел расхода воздуха при продувке объясняется универсальностью способа, предусматривающего как очень плотную загрузку сосудами со спермой (a этом случае необходима продувка до 0,4 объема камеры в 1 ч) так и минимальную загрузку, например 1 сосуд (чашка Петри) на 200- литровый термостат (при этом вполне достаточна продувка 0,004 объема камеры в 1 ч).

Воздух, используемый для продувки через термостат, должен содержать кислород не ниже нормального атмосферного уровня, температура его должна быть снижена до температуры мостат продувают воздухом со сКоростью 0,004-0,4 объема камеры в 1 ч.

Для смешивания спермы берут защитный раствор при следующем соотношении компонентов, мас. Ъ

Трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,5

Моногидрофосфат натрия 0,5-3,0

Гидрокарбонат натрия

Глюкоза

Бычий сывороточ- ный альбумин 0,005-0,1

Стрептомицина сульфат 0,001-0,01

Вода Остальное

Смешивание спермы с защитным раствором производят в соотношении

1:1, которое выбрано потому, что при изменении соотношения в сторону увеличения содержания спермы концентрация защитных добавок, входящих в раствор, становится недостаточной для сохранения оплодотворяющей способности спермы, а увеличение концентрации) добавок в сайом защитном растворе изменяет его осмотичность и тем самым делает его непригодным для использования.

Увеличение разбавления спермы защитным раствором приводит к неоправданному увеличению расхода реактивов и габаритов сосудов для хранения спермы, причем сохранность спермы при этом не повышается.

В процессе хранения спермы через термостат продувают воздух, что необходимо для обеспечения нормального дыхания спермы в процессе ее хранения.

При недостаточной продувке в сперме из-за накопления углекислоты происходит закисление спермиев и даже их гибель.

При излишне интенсивной продувке наряду с подсыханием спермы возникаеФ опасность развития губительных для клеток спермы процессов перекисного окисления.

1127554

Пример 2. 30 см> спермы осетра (Acipenser giildensthdti Brandt) с активностью 75% смешивают с 30 см раствора, содержащего, %: трис-цитхранения, а его относительная влаж- ность пос .е охлаждения должна быть не ниже 70Ъ.

Высота слоя спермы в сосуде 210 мм обусловлена необходимостью нормального газообмена и может колебаться для разных видов осетровых рыб.

Так, например, для спермы белуги и севрюги наилучшие результаты по лучаются при высоте слоя 5 мм, а 10 для осетровых русского и персидского видов высота слоя 10 мм еще не сказывается значительно на результатах хранения.

Высота слоя 10 мм является граничной для всех видов осетровых .рыб, и увеличение ее приводит к развитию значительной гипоксии при хранении (независимо от интндивности про-, дувки термостата).

При снижении высоты слоя спермы ниже 2 мм к сперматозоидам поступает повышенное количество кислорода и развивается гипероксия, при этом происходит защелачивание спермы (двиг. 0,5- 0,6 рН) за счет активизации внутриклеточного окисления, что приводит к гибели сперматозоидов, и создаются условия для развития перекисного окисления липидов

is сперме, что также небезопасно для нее.

Кроме того, сперма при хранении разделяется на два слон: слой осевших на дно клеток и плазму. Если влажностный режим во время хранения несколько смещается, плазма либо испаряется, либо обводняется, происходит изменение ее осмотического давления, которое при значительном смещении может вызвать гибель клеток. 40

Однако при высоте слоя 2 мм изменение осмотического давления не явля.ется губительным, так как слой клеток остается защищенным. слоем плазмы.

Пример 1. 50 см спермы белу- 45

3 ги (Hugo hugo L ) с активностью 80% смешивают с 50 см3 раствора, содержащего, Ъ: тряс-цитратного буфера рН 7,9 0,15; моногидрофосфата натрия 0,50; гидрокарбоната натрия

0Ä3; глюкозы 0,3; бычьего сывороточного альбумина 0,0050;. стрептомицина сульфата 0,001 и остальное речная вода. После перемешивания смесь разливают в сосуды слоем 2 мм и помещают в термостат с температурой 1 С, через который продувают о воздух со скоростью 0,004 объема камеры термостата в 1 ч. Через 5 сут хранения активность спермы 60%, опло. дотворяющая способность 70%. Ж ратного буфера рН 8,2 6,5; моногидрофосфата натрия 3; гидрокарбоната натрия 2; глюкозы 3,6; бычьего сывороточного альбумина 0,1; стрептомицина сульфата 0,001 и остальное речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 10 мм и помещают в термостат с температурой 10 С. В процессе хра- . нения производят продувку камеры термостата воздухом со скоростью 0,4 объема камеры в 1 ч. Через 5 сут активность спермы 65%, оплодотворяющая способность 72%.

Пример 3. Сперму севрюги (Acipenser stellatus. Pallas) с активностью 90Ъ в количестве 100 см смешивают. с 100 см раствора, содержащего, Ъ: трис-цитратного буфера рН

8,0 0,75; моногидрофосфата натрия 1; гидрокарбоната натрия 1,5; глюкозы

1,8; бычьего сывороточного альбумина 0,01; стрептомицина сульфата

0,005 и остальное-речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 5 мм и по- мещают в термостат с температурой

4 С, через который продувают воздух со скоростью 0,1 объема камеры термостата в 1 ч.

Через 5 сут хранения активность спермы 75-80Ъ, оплодотворяющая способность 92%.

Пример 4. Сперму белуги (Huso huso 1) с активностью 80% в количестве 30 см смешивают с 30 см раствора, содержащего, Ъ: трис-цитратного буфера рН 8,0 0,3; моногидрофосфата натрия 1; гидрокарбоната натрия 1; глюкозы 2; бычьего сывороточного альбумина 0,01; стрептомицина сульфЪта 0,01 и остальное речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 1 мм, помещают в термостат с температурой 5 С и продувают воздухом со скоростью 0,05 объема камеры в 1 ч.

Через 72 ч хранения наступает гибель спермы в результате частичного высыхания смеси.

Пример 5. 70 см спермы осетра (Acipenser duldensthdti

Brandt) с активностью 90Ъ смешивают с 70 см раствора, содержащего, %:

3 трис-цитратного буфера с рН 8,0 2; моногидрофосфата натрия 0,8; гидрокарбоната натрия 1,5; Глюкозы 0,5; бычьего сывороточного альбумина

0,05; стрептомицииа сульфата 0,01 и остальное — речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 3 мм и помещают в термостат при температуре 15 С с интенсивностью продуво ки воздухом 0,1 объема камеры в 1 ч.

Через 40 ч отмечается гибель клеток спермы.

Пример 6. Сперму севрюги (Acipenser, stellatus Pallas) с а*тивностью 80% в количестве 50 см

1127554

ВЫКИПИ Заказ 8773/2 Тираж 721 Подписное ЮЮЮЮЮВаЮ ю ЮМ

Фнлкал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4,смешивают с 50 см> раствора, содержащего, Ъ: трио-цитратного буфера рН 8,0 5; моногидрофосфата натрия

1,2; глюкозы 3; бычьего сывороточного альбумина 0,01; стрептомицина сульфата 0,01 и остальное - речная вода. Смесь разливают,: слоем 13 мм и помещают в термостат при,температуре 7 С. Термостат йродувается воэдухбм со скоростью 0;01 обьема камеры в 1 ч. Через 100 ч сперма погибает от недостатка кислорода на дне сосуда под слоем плазмы.

Пример 7. 100 см спермы белуги (Ниво huso 1 ) с активностью

90В смешивают с 100 см раствора, 15 имеющего в своем составе, Ъ: трисцитратного буфера рН 8,0 0,3; моногидрофосфата натрия 1; гидрокарбо. ната натрия 1; глюкозы 2; бычьего сывороточного альбумина 0,1; стреп- $0 томицина сульфата 0,01 и остальноеречная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 5 мм и помещают в термосо тат с температурой 5 С, который продувается воздухом со скоростью 25

0,002 объема камеры в 1 ч. Через

5 сут активность спермы 20-25%, оплодотворяющая способность. 22%.

Снижение рыбоводных качеств вызвано теми же причинами, что и в примере б.

Пример 8. Сперму севрюги (Acipenser stellatus Pallas) с активностью 753 в количестве 50 см смешивают с 50 см раствора, содер3 жащего, Ъ| трис-цитратного буфера рН 8,0 5; моногидрофосфата натрия

2,5 гидрокарбоната натрия 0,7; глюкозы 0,2; бычьего сывороточного альбумина 0,01 р стрептомицийа суль- 40 фата 0,01 и остальное — речная вода., Смесь, разлитую в сосуды слоем 4 мм, помещают в термостат. Температура хранения З-С, скорость продувки возо духом 0,07 объема камеры в 1 ч. Через

5 сут активность спермы составляет 45

40-45% оплодотворяющая способность

47%. Ухудшение рыбоводных качеств вызвано недостатком глюкозы.

Hp и м е р 9. 50 см спермы осетра (Acipenser guldenstadti 50

ВгапЖ) с активностьк 8ОЪ смешивают с 50 см раствора, имеющего в соста-:. ве, %: трис-цитратного буфера рН

8,0 0,05; моногидрофосфата натрия 3; гидрокарбоната натрия 21 глюкозы 55

З,б бычьего сывороточного альбумина

0,l; стрептомицина сульфата 0,01.и остальное — речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 4 мм и помещают в термостат с температурой

1(1 с, продувая-воздух со скоростью

0,4 объема камеры в 1 ч. Через 5 сут активность спермы 25Ъ, оплодотворяю- . щая способность 17Ъ. Низкие рыбоводные качества объясняются защелачи.ванием спермы при хранении вследствие недостаточной буферной емкости защит-. ного раствора.

Пример 10. Сперму севрюги (Acipenser stellatus Pallas) с активностью 90Ъ в количестве 100 см смешивают с 100 см раствора, включающего, Ъ: трис-цитратного буфера рН 7,5 0,15; моногидрофосфата натрия 0,5; гидрокарбоната натрия 0,3; глюкозы 0,3; бычьего сывороточного альбумина 0,005;стрептомицина сульфата 0 001 и остальное — речная во- да. Смесь разливают в сосуды слоем

3-мм и помещают в термостат с температурой 2 С, который продувается, 4 воздухом со скоростью 0,1 объема камеры в 1 ч.-.Через 5 сут отмечена единичная активность спермиев, оплодотворяющая способность отсутствует.

Ввиду низкого рН (7.,5) защитного раствора сперма частично активирована и теряет свои рыбоводные качества.

Пример 11. 100 см спермы белуги (Auso huso 1), имеющей активность 80%, смешивают с 100 см раствора, содержащего, Ъ: трис-цитрат- ного буфера 0,3; моногидрофосфата. натрия 1; гидрокарбоната натрия 1; глюкозы 2; .бычьего сывороточного альбумина 0,1; стрептомицина сульфата 0,0001 и остальное - речная вода.

Смесь разливают в сосуды слоем 5 мм . и помещают в термостат, где поддерживается температура 9 С и произвоо дится продувка воздухом со скоростью

0,006 объема камеры в ч. Через 100 ч сперма погибает в результате раз- > вития микрофлоры.

Предлагаемый способ позволяет удлинить переживаемость спермы до

5 дн с сохранением ее оплодотворяющей способности почти до 100В.Это дает воэможность транспортировать сперму с одного рыборазводного предприятия на другое, обеспечить ритмичность работы этих предприятий, сократить количество производителей путем более полного использования спермы. 3