Способ получения иммуносорбента

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА для вьщеления противогриппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена - вируса гриппа, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения сорбционной емкости по антигену , в качестве носителя используют макропористое стекзпо, которое подвергают модификации обработкой .парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при HO-IBO C и гидpoлизo f полученного продукта парами воды. 2. Способ по п. 1, о т ji и ч а ющ и и с я тем, что обработку парами винилтрихлорсилана ведут в течение 20-30 мин. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

as> SU и1) А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3600002/28-13 (22) 12 ° 04.83 (46) 15.12.84. Бюп. N - 46 (72) А.Н.Волкова,. А.И.Крашенюк, Л.В.Нагорная, В.Ю.Трекало, Н.Б.Федотова и В.И.Яковлев (71) Ленинградский ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени технологический институт им. Ленсовета (53) 543.544(088.8) (56) 1. Kay G. Leey M.D. Biocbim.

Biophys. Acta, 1970, 198, 276-28.

2. Meetall Н.Н. Biochem I. 1970, 117, 257.

2. G. of Immunological Methods, 1976, 13, 355-365.

3(я) A 61 К 39/12. А 61 К 47/00 (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИУНОСОРБЕНТА для выделения противогрнппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена — вируса гриппа, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения сорбционной емкости по антигену, в качестве носителя используют макропористое стекло, которое подвергают модификации обработкой. парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при 170-180 С и гидролизо:т о полученного продукта парами воды.

2 ° Способпоп. 1, отличаюшийся тем, что обработку парами винилтрихлорсилана ведут в течение 20-30 мин.

1 1128

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к имуннохимии, и может быть использовано для выделения чистых специфических антител методом аффинной хроматографии °

При иммобилизации антигена — ви.руса гриппа на нерастворимом носителе образуется специфический иммуносорбент, который должен обладать

М следующими свойствами: способностью fO адсорбировать антитела из смеси компонентов, освобождать адсорбированные антитела из комплекса со спе- цифическим сорбентом количественно при высокой степени их очистки от f5 сопутствующих аллергенов, обладать высокой сорбционной емкостью по специфическим антителам, обладать подходящими механическими свойствами, позволяющими фильтровать и напол-20 нять колонки, быть нечувствительным к микробному воздействию.и к.изменениям рН.

Известен способ получения иммуносорбентов для выделения антител, за- 25 ключающийся в обработке полисахаридного носителя: целлюлозы, сефадекеса, сефарозы, производных целлюлозы -2амико-4,6-дихлор-симм-триазином, раствором карбоната натрия и соляной кислоты с последующей промывкой водно-ацетоновой смесью и О, 1 M фосфатным буфером и связыванием антигена за счет реакции с аминогруппой (1) .

Недостатками известного способа являются сложность и длительность получения иммуносорбента, а также испол зование в качестве матрицы органических носителей, которые ме- 4О ханически непрочны, подвергаются дей» ствию микроорганизмов, обладают. структурной лабильностью, чувстви- тельны к изменениям рН.

Известен способ получения иммуно- 45 сорбентов путем взаимодействия неорганической матрицы и пористого стекла с / -аминопропилтриэтоксисиланом, заключающийся во взаимодействии очищенного путем нагревания в течение 3 ч в О, 1 M HNO высушенного при 90 С и нагретого до 700 С в те0 3 0 чение 3 ч в присутствии кислорода, стекла с 10Х-ным раствором -аминопропилтриэтоксисиланом в метиловом спирте или толуоле, в последующем превращении алкиламино-силанстекла в ариламинопроизводные с по 956 2 мощью реакции с rf-нитробензоилхлоридом, восстановлении нитрогрупп М а,5 0, и взаимодействии с антигеном (2, Недостатками данного способа являются сложность и длительность получения иммуносорбента, необходимость дополнительной активации после процесса силанизации поверхности стекла, применение органических растворителей: метилового спирта, толуола.

Наиболее близким к предлагаемому по достигаемому результату является способ получения иммуносорбента для выделения противогриппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена — вируса гриппа, заключающийся в следующем: носитель агарозу активируют бромцианом и затем проводят сорбцию.антигена (3) .

Недостатками способа являются низкая сорбционная емкость иммуносорбента по антигену 37-39Х, низкий выход антител при десорбции 1 M u

ЗМ ЦаД вЂ” 22-23Х при их низкой удельной активности, т .е . очистке О, 270,45 (удельная активность — это отношение титра выделенных антител. к концентрации белка). Возможность увеличения выхода антител за счет предварительной обработки кислыми буферными растворами приводит к усложнению технологии выделения антител, при этом наблюдается значительное количество сопутствующего выделенным антителам белка, т.е. низкая степень очистки †. удельная активность. 0,45.

Цель изобретения — повышение сорбционной емкости по антигену.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммуносорбента для выделения противогриппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена — вируса гриппа, в качестве носителя используют макропористое стекло, которое подвергают модификации обработкой парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при

170-180 С и гидролизом полученного.

0 продукта парами воды.

Обычно обработку парами винилтрихлорсилана ведут 20-30 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Иакропористое стекло обрабатывают в токе инертного газа парами винил3 11289 трихл >рсилана на 20-30 мин при 170180 С в реакторе проточного типа с о, последующим удалением непрореагировавшего винилтрихлорсилана и образовавшегося хлористого водорода, а затем гидролизом хлор-иона, входящего в состав продукта, парами воды и обработкой вирусом гриппа.

Иммобилизацию вируса проводят путем взаимодействия сорбента с проти- 1п вогриппозной вакциной. Лдсорбцию антител проводят из иммунной сыворотки в статических условиях бач-методом на электромеханической мешалке со скоростью вращения .11 об/мин в объеме сыворотки 2 мл при 25 С и времени о контакта 30 мин трижды. Отмывку антител проводят О, 1 М фосфатным буфером рН 7,2 с О, 15 M N аС1 порциями по 10 мп в течение 15 мин до полного удаления антител в отбираемых фракциях.

Титр антител определяют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Десорбцию антител проводят трис+НС0 рН 9 и 1 М и ЗГ1 К а3 буферными 25 растворами порциями по 10 мл в течение 15 мин до полного удаления антител в отбираемых фракциях.

В результате обработки образуется иммуносорбент, устойчивый в интерва- З0 ле рН 2,0-9,0.Вируссодержащий сорбент стабилен и может повторно ис- пользоваться в широких пределах диссоциации без заметной потери способности связывать антитела.

Количество винильных групп в поверхностном модифицированном слое сорбента О, 12-0, 14 мг-экв/г. Количество химически адсорбированного антигена — вируса гриппа — 15260 ГАЕ/г

40 сорбента (ГАЕ-произведение обратного титра на объем пробы), что составляет .

62Х от общего количества антигена.

Были проведены опыты по проверке специфичности пблученного иммуносор5 бента. В опытах использовали штамм ви- руса гриппа -385 (H> Н ) . Для этого использовали иммунную сйворотку к вирусу Х-54 (Н й,) . Биологическую активность антител определяли по реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)50 с использованием микротитратора Така" чи.Полученные результаты показали, что на данном иммуносорбенте неспецифические антитела не сорбировались, т.е. наблюдалась только биоспецифическая сорбция антител.

Выбранный интервал температур 170180 С обработки носителя парами ви0

56 4 нилтрихлогсилана обусловлен тем, что при этой температуре поверхность стекла наиболее гидроксилирована. .

Увеличение температуры приводит к дегидратации 0Н-групп на поверхности, а слецовательно, к снижению количества вступивших в реакцию РТХС групп, т.е. уменьшению модификатора в поверхностном слое и снижению активности, Уменьшение температуры обработки приводит к замедлению взаимодействия

ВТХС с гидроксильными группами, а также не исключает возможности присутствия молекулярно-связанной воды, которая при взаимодействии с ВХТС может привести к частичному нековалентному связыванию модификатора с поверхностью носителя, т.е. к снижению устойчивости сорбента. Выбранное время обработки носителя парами ВТХС

20-30 мин обусловлено тем, что 20 мин это то время, при.котором все гидроксильные группы поверхности вступают во взаимодействие с парами ВТХС . Увеличение времени обработки выше 30 мин нецелесообразно, так как поступающие пары, не реагируя, выводятся из реактора. Уменьшение времени контакта снижает количество модификатора в поверхностном слое, что снижает количество активных центров, снижает емкость сорбента по антигену — вирусу гриппа.

Пример 1. Навеску пористого стекла 1 г размером 2000 А и удельной поверхностью 25 м /r помещают в реактор проточного типа и в токе сухого инертного газа обрабатывают парами винилтрихлорсилана (ВТХС) при

170 С 20 мин с последующим удалео нием непрореагировавшего ВТХС и образовавшегося НС, затем проводят гидролиз хлор-иона, входящего в состав продукта, парами воды и далее проводят сорбцию вируса гриппа в объеме 2 мл противогриппозной вакцины в течение 1 ч при 25 С, полученный иммуносорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2.

Удаление непрореагировавшего ВТХС и образовавшегося НСР, а также гидро лиз хлор-иона контролируют по покраснению индикаторной бумажки, смоченной метилоранжем. Конец — отсутствие покраснения. Примерное время удаления 3-5 мин, гидролиз 5-7 мин. Количество винильных групп на сорбенте

1128956

Удельная активность антител

Количество снятых антител с иммуносорбента, Х

0 35

3 7-39

Агароза + В С

+ вирус гриппа прототип трис+НС3+1Ми ЗМ g a J

22-23

Обработка кислым буфером и снятие .трис+НС6+ЗМ NaI

О, 45

О, 12 мг-экв/г. Емкость сорбента по вирусу гриппа штамм А-385 (He ll )

15264 ГАЕ/г сорбента, что составляет

62,1Х. Затем навеску сорбента 0,5 r с иммобилизованным вирусом гриппа по- 5 мещают в объем 2 мл иммунной сыворот-ки и проводят адсорбцию антител до полного насьпцения сорбента — 3 раза по 30 мин при 25 С, отмывают фоновым о буфером и проводят десорбцию по описанной методике. В качестве элюирующих растворов используют трис+НС1 рН 9 ° 0 с 1 М и ЗМ К à J . Количество десорбированных (выделенных) антител составляет 50Х. Количество белка, сопутствующего снятым антителам, 2.,0 мкг/мл, общий титр снятых антител 1:80. Удельная активность выделенных антител 40.

П р и g е р 2. То же, что в при- 20 мере 1, но навеску стекла обрабатывают парами ВТХС при 170оС 30 мин., Емкость сорбента по вирусу гриппа—

1антигену — 15258 ГАЕ/г сорбента, что составляет 62Х ° 25

Количество десорбированных антител 47,8Х. Количество белка, сопутствуппцего выделенным антителам, 1,9.мкг/мл. Общий титр снятых антител 1:62. Удельная активность анти-. ЗО тел 32,6 ..

Пример 3. То же, что в примере 1 но навеску стекла обрабатыУ о вают парами ВТХС при 180 С. 20 мин.

Емкость сорбента по антигену

15289 ГАЕ/г сорбента, что составляет 62,2Х. Колйчество десорбированных антител 51 5Х. Общий титр снятых антител 1:88. Количество белка, сопутствующего антителам, 2, 1Х. Удельная активность антител 41,9.

Данные по сравнению полученных результатов с прототипом, а также с контролем, где был взят сорбент, модифицированный группами без иммобилизованного вируса гриппа, представлены в таблице.

Как видно из таблицы, количество адсорбированного антигена —. вируса гриппа в 1,6 раза вьппе, чем в прототипе, при зтом количество снятых антител в 2,2 раза вьппе, чем в.прототипе, в случае выделения антител без дополнительной обработки сорбента с комплексом антиген-антитело. Степень очистки выделяемых антител от сопутствующего белка в 93-120 раз вьппе, чем в прототипе, независимо от способа элюцииантител с поверхности иммуносорбента.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет приго.— товить иммуносорбент на основе пористого стекла, содержащий в поверхностном слое винилсодержащие группы и антиген — вирус гриппа. ;

Этот сорбент получается по упрощенной технологии,. не требует затрат большого количества времени и вредных ядовитых реактивов, химически устойчив, дешев, долговечен и, главное,обладает высокой сорбционной емкостью по антигену — вирусу гриппа, что позволяет повысить выход чистых антител в 2,2 раза при увеличении степени из очистки от белка в

90-120 раз.

1!28956

Продолжение таблицы

1 ) 4

Винилс оде ржащее пористое стекло + иммобилизованный вирус гриппа

4I,9

51,5

62,1

Ви нилс од ержаще е пористое стекло без иммобилизованного вируса гриппа

Заказ 9269/6 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,, Рауушская наб., д. 4/5

1».Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

С ос тави тел ь О. С кор одумова

Редактор Н.Горват Техред А..Бабинец Корректор H.MVcKa