Способ получения фаголизосомальных структур фагоцитирующих клеток

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ФАГОЦИТИРЛОЩИХ КЛЕТОК путем получения клеток,смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитируемый материал. проведения фагоцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур, о т личагощийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода целевого продукта, в качестве фагоцитируемого материала используют частицы карбонильного железа диаметром 1-5 мкм в количестве 20-50 мг на 100Ю фагоцитирующих клеток с последующим отделением фаголизосомальных структур из разрушенных клеток в постоянном магнитном поле с напряженностью 400-1000 Э.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (I 9) (11) 4(51) 01 N 33 48

".(11« «ц1Я г v . ю

)

:"; ч:-жи,ъ

I (1„

«

ОГ1ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3567686/28-13 (22) 21.03.83 (46) 23.02.85 ° Бюл. 9 7 (72) В.M.Çåìñêoâ, А.В.Храмцов, В.И.Пантин, М.С.Бибо и И.С.Калько (71) Институт иммунологии (53) 591.111.7(088.8) (56) 1."Ехрех.Med. 1971, Р 133,, р.785 ° (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ФАГОЦИТИРУЮЩИХ

КЛЕТОК путем получения клеток,смешивания их с инкубационной средой, . содержащей фагоцитируемый материал, проведения фагоцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода целевого продукта, в качестве фагоцитируемого материала используют частицы карбонильного железа диаметром 1 — 5 мкм в количестве 20-50 мг на 100 10 фагоцитирующих клеток с последующим отделением фаголизосо-. мальных структур из разрушенных клеток в постоянном магнитном поле с напряженностью 400-1000 Э.

1141338

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения внутриклеточных органелл.

Известен способ получения фаголиэосомальных структур фагоцитирующих клеток путем получения клеток, смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитируемый материал, проведения фагйцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур Ц . ,Однако известный способ не позволяет получать в достаточном количестве высокоочищенные препараты.

Целью изобретения является повышение чистоты и выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фаголиэосомальных структур фаго. цитирующих клеток путем получения клеток, смешивания их с инкубационной средой, содержащей фагоцитируемый материал, проведения фагоцитоза с последующим разрушением клеток и выделением фаголизосомальных структур, в качестве фагоцитируемого материала используют частицы карбонального железа диаметром

1-5 мкм в количестве 20-50 мг на

100 10 фагоцитирующих клеток с пос6 ледующим отделением фаголизосомальных структур из разрушенных клеток с в постоянном магнитном поле с нап ряженностью 406-1000 Э.

Пример . Фагоциты получали промыванием брюшной полости мышей CBA средой Игла с 0,2Ъ-ным бычьим сывороточным альбумином и 20 ед. гепарина/мл. Клетки осаждали центрифугированием в течение 8 мин при

1200 об/мин при t=O — 4 С..После этого осадок ресуспендировали в этой же среде без гепарина и вновь центрифугировали в том же режиме.

Монослой клеток получали путем их инкубации при 37 С в течение б0 мин в атмосфере 5Ъ СО2 в среде Игла, содержащей 5% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки и

10 мМ НЕРЕЯ (рН 7, 2). Неприлипшие клетки удаляли 3-кратным промыванием монослоя раствором Хенкса, количество прилипших клеток определяли на инвертированном микроскопе, к монослою клеток добавляли карбониальное железо, опсонизированное нормальной мышиной сыворот кой, из расчета 34 мг на 100 10 клеток.

Фагоцитоз проводили в течение

60 мин при 37 С в атмосфере 5% СО в вышеназванной среде. Нефагоцитированные частицы карбонильного железа удаляли 3-кратным промыв нием монослоя клеток раствором Хенкса,клетки снимали с чашек кисточкой, осаждали при 1200 об/мин в течение

8 мин при =0-4 С, ресуспендировали в среде выделения, содержащей

0,25 N сахароэу и 10 мМ НЕРЕЯ (рН 7,2) и разрушали в гомогенизаторе.

Полученный гомогенат с помощью перистальтического насоса пропускали в магнитном поле, задержанный на магните материал промывали средой выделения, собирали и подвергали энэимологическому анализу.

Напряженность магнитного поля составляла 400 Э. Исследовались активности 5-нуклеотидазы (маркер плазматической мембраны), кислой фосфатазы(лизосомальный маркер) и лактатдегидрогеназы (марнер цитозода). Полученные данные представлены в таблице.

Представленные данные указывают, что предложенные процедуры позволяют B один этап в магнитном поле получать фракцию, обладающую специфической ферментативной активностью маркеров плазматической мембраны и лизосом, более чем в 10 раз превышаюшую эту актив35 ность в исходном гомогенате. Это свидетельствует о том, что получаемая в магнитном поле фракция представляет собой фаголизосомальные структуры фагоцитирующих клеток.

4Q По активности же лактатдегидрогеназы одного из ферментов, протекающего в цитозоле гликолиэа, можно судить о загрязненности выделяемых структур неразрушенными фагоцитами. В пересчете на общую активность такое загрязнение составляет меньше 1Ъ.

Использование способа позволяет значительно повысить чистоту получаемых фаголиэосомальных структур.

В предлагаемом способе загрязнение составляет меньше 1%, тогда как в известном оно достигает 53. Возра-стает количество получаемых фаголизосомальных структур, так как им придаются специальные характеристики, коренным образом отличающие их от других клеточных органелл.

Кроме того, упрощается весь процесс выделения,который представляет в предлагаемом способе только деление материала в магнитном поле.

1141338

Ф

Специфическая активность

Отношение активностей

Фермент

Фракция

Гомогенат фракция гомогенат

0,74 + 0,17 7,88 0,94

3,10"0,47

0,28 + 0,05

Лактатдегидрогеназа

0,87 + 0,08 3,15 0,04

0,17

5-Нуклеотидаза и кислая фосфатаза даны в мкМ P /ч мг; лактатдегидрогеназа в Фе/мг

Составитель E.Æèòíèêoâà

Редактор A.Øèøêèíà Техред M.Ïàðoöàé Корректор С.черни

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4

5-Нуклеотидаза

Кислая фосфатаза Заказ 489/33 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

10,6

11,0