Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена

 

СНОСОВ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуальноили колориметрически , отличающийс я тем, что, с целью повьшения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (594 G 01 35 ф1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,-

К ABTOPCMOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3697951/30-15 (22) 16.02.84 (46) 30.10 ° 87. Бюл. М 40 (71) МГУ им. M,В.Ломоносова (72) А,А,.Байков, А.В,Кулинич, С.M,Àâàåâà и И,Г.Атабеков (53) 632,938(088,8) (56) Дзантиев Б.Б., Егоров А.М. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа.

Журнал Всесоюзного химического обs(ecxsa им, Д.И,Менделеева, 1982, т. 27, У 4, с. 82-89.

О $11111чап М.У., Bridges У.?...

Marks V. Fnzyme immunoassay: à reviev. Ann. Clin. Biochem. 1979, N- 16, р, 221-240 °

Патент СП1А М 3839153, кл. 195-103, 5, 1974.

Патент Великобритании М 1597754, кл, С 1 В, 1979, Патент С1(!А М 4298686, кл, 435-7, !981.

Lommel $.А., McCaiп А.Н. Morris Т.Y. Evaluation of inderect епкуте-linked inmunosorbent assay 1ог

the detection of e1ant viruses.

Phytopathology, 1982, v. 72, 1(8, р, 1018-10?2. (54)(57) СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНА, включающий получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и уменьшения расхода субстрата, в качестве субстрата используют раствор соли пирофосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ.

1

11536

Изобретение относится к сельскому хозяйству и медицине и может быть использовано для определения антигенов в биологических и других объектах.

Иммунологический метод анализа с использованием антител, меченных Аерментом (иммуноферментный анализ), получает все большее распространение благодаря простоте, высокой чувствительности и отсутствию необходимости работы с вредными для здоровья веществами. Наиболее широко используется метод гетерогенного иммунофермент- 15 ного анализа, при котором соединение антитела с Аерментом (коньигат) присоединяют к поверхности твердой фазы.

Существующие способы гетерогенного иммуноферментного анализа различаются, главным образом, типом фермента, использованного для получения коньюга та, Известны способы гетерогенного иммуноферментного анализа антигена с применением р-галактозидазы, пе" 25 роксидазы, каталаэы, глюкозоксидазы, амилазы и 4.5, 3-кетостероидизомеразы.

Субстраты этих ферментов — сложные органические соединения, нестойкие 30 при хранении. Визуальный анализ результатов определения при низкой концентрации антигена обычно затруднен из-за невысокой интенсивности окраски или высокой величины фона.

Наиболее близким по технической сущности является способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена, включающий получение коньюгата специАического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или ко- 45 лориметрически. В качестве субстрата в этом способе используют п-нитрофенилфосфат. Для получения конвюгата специфического антитела и щелочной фосфатазы их смесь обрабатывают глутаровым альдегидом, после чего избыток последнего удаляют диализом или гельфильтрацией. Для присоединения антигена к поверхности твердой фазы в пластмассовый сосуд помещают на несколько часов раствор специфического антитела, промывают сосуд буферным раствором, а затем помещают в него раствор образца, в котором требуется

69 2 определить содержание антигена. Последний присоединяется к стенкам сосуда в результате взаимодействия с адсорбированными на них специфическими антителами, Затем в сосуд помещают раствор коньюгата специфического антитела с щелочной фосфатазой, в результате чего коньюгат связывается с антигеном в количестве, пропорциональном содержанию последнего в образце. После этого прибавляют раствор субстрата, п-нитрофенилфосфата и инкубируют с ним. Продуктом ферментатив. ной реакции является п-нитрофенол, количество которого измеряют колориметрически при 405 нм, При количественном определении используют калибровочный график, который получают, беря вместо образца растворы антигена известной концентрации. Качественно присутствие антигена в образце определяют визуально по появлению желтой окраски.

Однако недостатком способа является невыская чувствительность, что связано с тем, что продукт реакции, п-нитрофенол, имеет невысокий коэффициент экстинкции (15000 М см " ), и возникающая желтая окраска плохо воспринимается визуально. Допустимый срок хранения субстрата в растворенном виде составляет около 1 недели, в твердом виде субстрат заметно разлагается даже при хранении при пониженной температуре, что приводит к

1 возрастанию фона, При определении активности щелочной фосфатазы используют высокую концентрации субстрата (10 мМ), что связано с высоким значением константы Иихаэлиса (.1-3 мМ) °

Целью изобретения является повышение чувствительности и уменьшение расхода субстрата, Поставленная цель в способе гетеро-; генного иммуноферментного анализа антигена, включающем получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена иэ образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или колориметрически, достигается тем, что в качестве субстрата используют раствор соли пироАосфорной кислоты в концентрации 0,02-1 мМ.

Таким образом, сущность изобретения заключается в использовании раст3 11536 вора соли пирофосфорной кислотй вместо п-нитрофенилфосфата. Продуктом ферментативной реакции в описываемом способе является ортофосфат для определения которого используется цвет-5 ная реакция, изменение коэффициента, экстинкции для которой составляет около 70000 M см ", что в 4,6 раз выше, чем для п-нитрофенола. Поэтому, несмотря на то, что скорость образования ортофосфата из соли пирофосфорной кислоты равна 407 скорости образования п-нитрофенола из п-нитрофенилфосфата, измеряемая оптическая плотность в описываемом способе в

1,8 раза выше. Кроме того, измеряемая окраска изменяется от бледно-желтой в отсутствии определяемого антигена до ярко-синей в его присутствии, что наиболее благоприятно для визуальной оценки результатов анализа. В сумме эти два фактора значительно увеличивают чувствительность определения, особенно при качественном анализе 25 наличия низких концентрацией опреде,— ляемого. антигена. Соль пирофосфорной .кислоты, используемая в качестве субстрата, устойчива неограниченное время в твердом состоянии, до 1 года в растворе при 4оС и до 2 месяцев в

Таблица!

Концент рация вируса, мг/мл

Оптическая плотность

Предлагаемый способ при указанных концентрациях соли пирофосфорной кислоты, мМ звестный пособ

0,0? . О,l 1

45 0,2

0 5

0.,781 0,79

l,45 1,50

l,19 1,44

1,5., 1е5

Как видно из табл.l, оптическая плотность, измеренная предлагаемым способом, выше чем измеренная известным способом. Видно также, что опти55 ческая плотность в присутствии антигена возрастает с ростом концентрации соли пирофосфорной кислоты, Однако при этом возрастает также величина растворе при комнатной температуре, Константа Михаэлиса для щелочной фосфатазы по пирофосфат-иону составляет около 15 мкм, по причине чего можно использовать концентрацию соли пирофосфорной кислоты 100 мкм, что в

100 раз меньше чем для п-.нитрофенилфосфата, Преимуществом изобретения является также значительно меньшая стоимость субстрата.

Пример 1, Определение анти-. гена — вируса У картофеля, Коньюгат антител к вирусу У и щелочной фосфатазы кишок теленка получали обработкой их смеси водным раствором глутарового альдегида в концентрации 0,1 мас,Х, В углубления микроплаты для иммуноферментного анализа последовательно помещали на 1015 ч при 4 С по 0,2 мл раствора антител (2 мкг/мл) в карбонатном буфере рН 9,6, исследуемого экстракта или суспензию очищенного вируса У в 0,1 М буфере трис-НС1 рН 7,5, раствора коньюгата (0 3 ед/мл) в 0 1 M буфере трис-НС1 .рН 7,5 с промежуточной промывкой раствором твин-20 (0,1 мас.7) 69

4 и водой, прибавляли 0,2 мя раствора

Na P О 10Н О в 0,1 М буфере трисНС1 рН 8,5 и инкубировали 15 мин при

20 С. Реакцию с субстратом останавливали прибавлением 0 05 мл окрашивающего реагента следующего состава, мас,Ж: мопибдат аммония 1,3, краси-! тель малахитовый зеленый 0,07, Твин20 - 0 15 серная кислота 20, остальное — вода, Через 10 мин измеряли оп-. тическую плотность при 630 нм с помощью денситометра, Для получения сравнительных данных параллельно производили определение вируса У в образцах известным методом, используя те же препараты антител и коньюгата. Раствор субстрата содержал 10 мМ п-нитрофенилфосфата,! M диэтаноламин-НС1 рН 0,8 и

0,5 мМ МдС1 ° Для остановки реакции с субстратом прибавляли 0,05 мл 4 M водного раствора NaOH. Оптическую плотность измеряли при 405 нм.

Данные для ряда известных концентраций вируса У (калибровочные зависимости) сведены в табл. 1.

О - 0 065 0,040 0,074 0 164.

0,05 0,125 0,090 0,169 0,268

0,313 0,294 Оэ451 0,512

1153669

Т а б л и ц а 2

Образе

Содержание вируса У, мкг/мл

Известный способ редлагаеN способ

0,14

0tl2

0,85

0,79

0,06

6,7 0,132

0,281

0,589

20 денситометра.

Редактор Н.Сильнягина

Техред И.Попович Корректор А. Обручар

Заказ 5205

Тираж 775 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, R-35, Раушская наб., д. 4/5.Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 оптической плотности в отсутствии антигена (фой). При концентрации соли пирофосфорной кислоты 0,02 и 0,1 мМ оптическая плотность стабильна в те5 чение часа, а при концентрации 1 мМ— возрастает на 0,2-0,4 единицы, Таким образом, оптимальной является концентрация 0,1 мМ.

При визуальном анализе обнаружено, что окраска проб изменяется от бледно-желтой в отсутствии антигена до ярко-синей при высокой концентрации антигена. Окраска в пробах с оптической плотностью выше 0,15 достоверно отличается.от окраски фона. В известном способе окраска изменяется от бесцветной до желтой, и окраска проб достоверно отличается от окраски фона лишь при оптической плотности выше 1 единицы, При определении содержания вируса У в экстрактах двух образцов лис- 26 тьев картофеля получены следующие результаты, приведенные в табл. 2, Как видно, два способа дают близкие значения, Предлагаемым способом наличие вируса=у в образце l.определяется визуально, тогда как в известном способе обязательно использование

Пример 2 ° Определение 13 S-гло-. булина семян гречихи.

Способ осуществляется согласно примеру 1, используя антитела к 13Sглобулину семян гречихи и следующие концентрации ингредиентов окрашивающего раствора, мас.Х: молибдат аммония 0,3, малахитовый зеленый 0,017, твин-20 -0,04, серная кислота 1 н.

Ниже приведены данные, полученные для ряда концентраций 138-глобулина семян гречихи.

Концентрация 13S-глобу- Оптическая лина семян гречихи, плотность мкг/л