Способ определения активности ингибиторов протеаз

 

СПОСОБ ОПРЩЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ путем определения разности активности протеазы при инкубации в присутствии и отсутствии ингибитора , отлияа ющийся тем, что, с целью сокращения времени определения, инкубацию проводят в течение 1-2 мин при 27-33° С, а об активности ингабитора протеазы судят по разности скорости падения свечения при добавлении инкубациоиной смеси в раствор, содержащий люшферазу, НАДН:ФМН-ок(Я1доредуктазу и субстраты этих ферментов.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК.Э

4(5l) 6 01 Й 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .

И ABT0PCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3667345/28 — 13 (22) 21.10.83 (46) 07.06.85. Бюл. Р 21 (72) Г. А. Кратасюк, В. Н. Петушков, С. А. Рыков и И. И. Гительзон (71) Институт биофизики Сибирского отделения АН СССР и Красноярский государственный медицинский институт (53) 543.866 (088.8) (56) Веремеенко К, H. Кнниновая система.—

Кнев, "Наукова думка", 1977, с. 161 — 162.

„„ЯО„„! !603!! А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ путем определения разности активности протеазы лри ннкубации в присутствии и отсутствии ингибитора, отличающийся тем,что, с целью сокращения времени определения, ин-, кубацию проводят в течение 1 — 2 мин при

27 — 33 С; а об активности ингибитора нротеазы судят по разности скорости падения свечения при добавлении инкубационной смеси в раствор, содержащий люциферазу, НАДН:ФМН вЂ” оксндоредуктазу и субстраты этих ферментов.

1160311

1.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в технической микробиологии и медицинской диагностике.

Целью изобретения является сокращение времени определения.

Пример. Использовали в качестве инги бито ра проте азы контрикал (про извод ство ГДР) и гордок (производство Венгрии). В качестве протеазы использовали трипсуф "Яегча", ФРГ) с удельной активностью 40 ед на 1 мг препарата и в качестве люциферазы — частично очищенный препарат

, из Photobacterium feiognothi.

К 100 мкл раствора трипсина (100 мгк/мл) . - добавляют 20 мкл раствора контрикала (100 АЕ/мл) или 20 мкл раствора гордокса (100 КИБ/мл) и инкубируют в течение 2 мин ..при 30 С, а затем берут аликвоту объемом

120 мкл и добавляют в реакционную смесь, содержащую 20 мкл ферментного препарата (0,3 мг/мл лнщиферазы и НАДН:ФМН вЂ” окси1торедуктазы), 50 мкл 0,005%-ного раствора миристинового альдегида, 50 мкл

6,6.10 М ФМН, 360 мкл 0,1 фосфатного буфера рй ?,0 и 300 мкл 2,68-10 М НАДН.

Благодаря избытку протеазы в инкубационной смеси наблюдается падение свечения, обусловленное инактивацией люциферазы под действием остаточной активности протеазы.

Сигнал из кюветы прибора, для измерения свечения подают на ФЭУ, à с последнего— на самопишущий потенциометр с известной скоростью протяжки масштабной ленты.

Остаточную протеазную активность определяют по константе инактивации люциферазы, которая вычисляется по формуле

Ингибитор протеаэы

40 50

0,95 0,52

0 . 10 20

2,4 1,96 1,66

К„„люциферазы, мин

О, 10 - 20 40

2,4 1,92 1,60 0,82

65

К„„люциферазы, мин "

0,40 О

Составитель Н. Гуляева

Техред Л.Коцюбняк Корректор Е, Сирохман

Редактор В. Иванова

Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35„Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3766/41

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Раствор гордокса (100 КИЕ/мл), мкл на пробу

Раствор контрикала (100 АЕ/мл) мкл на пробу ьJ,- -e-, IC ин где ./„и ? — биолюминесценции в момен

5 ты времени т„и t соответственно.

Измерение падения биолюминесценции проводят в течение 1 мин. Активность ингибитора протеазы определяется разностью между константами инактивации люциферазы в присутст10 вии и отсутствии ингибитора протеазы, Константа инактивации люциферазы обратно пропорциональна количеству добавленного ингибитора протеазы (таблица) .

Измерение биолюминесценции проводят в термостатируемой кювете при 30 С в течение

1 мин. В контроле к 100 мкл раствора трипсина добавляют 20 мкл 0,1 М фосфатного буфера.

Константа инактивации в контроле равна .2,4 мин ", в опыте с контрикалом 1,60 мин " и в опыте с гордоксом 1,66 мин ".

Расчет: в инкубационной смеси находилось

10 мкг трипсина. На определение взято 20 мкл (0,02 мл) раствора гордокса 100 КИЕ/мл (1:50). Разность К„„в контроле и опыте

25 равна 0,74 (2,4 — 1,66), что соответствует инактивации около 3 мкг трипсина. Слецова. тельно, 1 мл гордокса связывает

3,0 50

О 02 — 7500 (м ) рип

Таким образом, в предлагаемом способе

30 активность ингибитора протеазы выражается в мг протеазы, связываемых (инактивируемых) мл исследуемого препарат антипротеазы.

Предлагаемый способ сокращает время определения ;qo 3 мин, т. е. более, чем в

20 раз в сравнении с известным способом, Концентрация ингибитора протеазы .