Способ получения иммобилизованных нуклеофильных лигандов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕОФИЛЬНЫХ ЛИГАНДОВ путем активации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,б-трихлор-1 ,3,5-триазином с последующей иммобилизацией лигандов, о т л ичающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления процесса, активацию носителя проводят в водном буферном растворе при рН 7,59 ,5, а 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин используют в виде концентрированного раствора в водорастворимых апротонных органических растворителях в количестве 5-50% от сухой массы носителя.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

4у11 С 12 N 11/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ABTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3639020/28-13 (22) 31.08 83 (46) 15.06.85. Бюл. N 22 (72) Г.И. Денис, Ю.Ю. Степонавичюс, З.Ю. Йонушене, A. — Ñ.A. Глемжа, А.А. Воробьев, И.И. Кюдулас, В.И. Лауцюс и Д.И. Вайткене (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (53) 577.15 (088.8) (56) 1. Иммобилизованные фермен ты. Пад ред. И.В, Березина и др.

1976, Г1.: ИГУ, т.1, с. 83.

2. Патент США У 4229537, кл. 435-177, опублик. 1980.

„„SU 52 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИМОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕОФИЛЬНЫХ ЛИГАНДОВ путем активации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазином с последующей иммобилизацией лигандов. о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения и удешевления процесса, активацию носителя проводят в водном буферном растворе при рН 7,59,5, а 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин .используют в виде концентрированного раствора в водорастворимых апротонных органических растворите- лях в количестве 5-50Х от сухой массы носителя.

1161552

Однако способ характеризуется сле дующими недостатками стадия актива-.

: ции носителя является сложной и продолжительной; в больших количествах И5 используются токсичные, легко воспламеняющиеся органические растворители и третичные амины (например, для получения 4 г активированной сефарозы нужно 3-4 л органических раст 50 ворителей), что требует специального оборудования помещений и других мер но обеспечению безопасности труда, ввиду трудоемкости 1троцесса и использования больших количеств 55 органических растворителей и других реагентов стоимость активированного носителя весьма высокая.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения иммобилизованных на нерастворимых носителях белков и других лигандов. 5

Известен способ иммобилизации ферментов и других биологически важных веществ на нерастворимых носителях (целлюлозе) с использованием 2-амико-4,6-дихлортриазина, 10

Активацию проводят в среде ацетонвода (2:1) при 1,5-3-кратном избытке модификатора по отношению к сухой массе целлюлозы P).

Однако способ характеризуется 15 необходимостью использования больших избытков 2-амино-4,6-дихлортриазина и органических растворителей в больших количествах (500 мл ацетона на 5-10 г целлюлозы).

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения иммобилизованных нуклеофильных лигандов путем акти- 25 вации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,6-трихлор-1, 3,5-трназином (ТТ) с последующей иммобилизацией лигандов. В данном

;способе тщательно обезвоженный носитель обрабатывают ТТ в органическом растворителе (диоксан, ацетонитрил) s присутствии третичного амина (N,N-диазопропилэтиламина,N.N-диметиланилина) для связывания выделяющегося НС1 . Активированный носитель многократно промывают тем же органическим растворителем и применяют для иммобилизации лигандов. Допускается хранение активированного носителя после высушивания (2) .

Цель изобретения — упрощение и удешевление процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилнзованных нуклеофильных лигандов путем активации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазином с последующей иммобилизацией лигандов. активацию носителя проводят в водном растворе.при рН 7,5-9,5, а 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин используют в виде концентрированного раствора в водорастворимых апротонных органических растворителях в количестве 5-507. от сухой массы носителя.

Сущность изобретения заключается г в том, что взаимодействие ТТ с носителями происходит в водном буферном растворе при рН 7,5-9,5 при минимальном внесении органического апротонного растворителя, растворимого в воде. Количества ТТ, используемые при активации, низки (5-507 от сухой массы носителя) по сравнению с известными способами.

Активированный носитель может храниться в сухом виде, но предпочтительно иммобилизацию лигандов проводить сразу же после активации.

Если лиганд не подвергается нежелательному воздействию ТТ (например, инактивации в случае ферментов),иммобилизацию можно проводить в той же реакционной смеси, в которой проводится активация носителя (т.е. не отделяя непрореагировавшего ТТ и

1 продуктов его гидролиза). Это сокращает число технологических операций и продолжительность процесса.

Предлагаемый способ иммобилизации можно применять с любыми носителями, содержащими нуклеофильные функциональные группы, но наиболее эффективен он для носителей, содержащих гидроксильные группы (нерастворимые в воде полисахариды — целлюлоза, сефароза, синтетические гидроксилсодержащие полимеры — поливиниловый спирт). В пределах рН и температуры, предлагаемых в изобретении, гидроксильные группы являются менее активными нуклеофилами по сравнению с аминогруппами или с сульфгидрильными группами, которые обычно содержатся нз лигандах. Поэтому связывание лигандов по этим группам на активированном носителе протекает быстрее по сравнению с побочными реакциями гидролиза активных групп и поперечной сшивки цепей носителя.

Иммобилизация по предлагаемому способу проводится двумя путями: реакционная смесь фильтруется, активированный носитель промывается и используется для иммобилизации лигандов или хранится в сухом виде

D при 0-4 С; иммобнлизация проводится без отделения активированного носителя — после активации температура и рН реакционной смеси доводится до необходимых для иммобилизации значений и добавляется раст ,вор лиганда.

Пример 1. Иммобилизация нейтральной протеазы В. subtilis на активированной порошкообразной целлюлозе.

Целлюлозный порошок (100 г) суспендируют в 100 мл 0,1 М боратного буфера рН 9.,0, охлаждают до о

10 С, добавляют 5 г ТТ, растворенного в ацетоне, и перемешивают

t0 мин. Смесь фильтруют, промывают ацетоном с водой (1:1), суспендируют в 800 мл О,. t M фосфатного буфера рН 7,2, добавляют 400 мл раствора протосубтилина Г10х (содержание белка 3 мг/мл) и перемешивают

10 ч при 10 С. Полученный продукт промывают 1 M раствором NaCt! до исчезновения белка в промывных водах и 1 л смеси этанол: 1 М БаСС (1:1).

Получаются 250 r влажного препарата иммобилиэованной протеазы В. subtiИз с активностью 1,8 ед/г сухого веса и содержанием белка 5 мг/г сухого носителя. За единицу протеолитической активнооти принимают ,количество фермента, которое за

1 мин при 37,0 + 0,5 С превращает в неохлаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеинат натрия в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина.

Пример 2. Иммобилизация щелочной протеазы В. subtit is на мелкодисперсной целлюлозе.

Готовят 1000 мл 10Х-ной суспензии мелкодисперсной целлюлозы в 0,1 M универсальном буфере рН 7,5. При перемешивании добавляют 10 г ТТ,растворенного в диоксане. Активацию прово дят 80 мин при 0 С. Смесь фильтруют, промывают смесью ацетона с водой (i:1), суспендируюг в 1000 мл 0,1 М универсального буфера рН 9,5, цо1161552 4 бавляют 500 мл раствора щелочной протеазы (содержание белка 3,9 мгlмл) и перемешивают в течение 7 ч прн

10 С. Полученный продукт промывают

1 M NaCt „ смесью этанол : 1 M БаСК, (1:1). Получают 500 г влажного препарата, который хранится в виде

50Х-ной суспензии в О, 1 М NaC E. .Протеолитическая активность 13,2 ед/г

1р сухого веса препарата, содержание белка t8 мг/г.

Пример 3. Иммобилизация уреазы на сефарозе.

100 мл сефарозы 6Б (сухая масса 6 г) суспендируют в 1000 мл

0,1 M боратного буфера рН 8,5, добавляют 3 г ТТ, растворенного в диоксане, и перемешивают при 15 С

20 мин. Реакционную смесь фильтруют, промывают смесью ацетона с водой и активированную сефарозу суспендируют в 1000 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 ° Добавляют 200 мл водного раствора уреазы (содержанне белка

5 мг/мл, активность 180 ед/мл) и перемешивают 5 ч при 10ОC.- Продукт промывают 1 М раствором NaC В. Полу чают 24 г влажного препарата иммобилизованной уреазы с активностью

300 ед/г и содержанием белка

28,5 мг/г препарата. За единицу уреазной активности принимают такое количество фермента, в результате взаимодействия которого с субстра35 том (мочевиной) выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 мин при 30 С.

Пример 4. Иммобилизация липопротеида на хитине.

100 r хитина, суспендируют в

1000 мл 0,1 M универсального буфера рН 8,5. Добавляют 20 r ТТ, растворенного в диоксане, и перемешивают 20 мин при 5 С. После активации рН реакционной смеси доводят ,до 9,5, добавляют 10 г липопротеица яичного желтка, растворенного в этаноле. Смесь перемешивают 7 ч при ,20 С, после чего фильтруют промывают 1 И NaC3 и 50Х-ным водным этанолом. Продукт содержит белка

32 мг/г сухого носителя.

Пример 5. Иммобилизация

1,6-диаминогексана иа сефарозе.

100 мл сефарозы 4Б (сухая масса 4 г) суспендируют в 50 мл борат" ного буфера рН 9,5. Добавляют 1 г

ТТ, растворенного в тетрагидрофу" ране, и перемешивают 10 мин при о

10 С. Активированную сефарозу про1161552

ВНИлПИ ЗекеаЗ)38/31 Тилак 525 лолллоиое

4илиал ППП «Пееелое, r. Уиоорок,ул.Проекеиал, е мывают 0,1 И карбонатным буфером рН 9,5 и смешивают с 50 мл 1 M раствора l,á-pza imvorezcaza. Смесь перемешивают 2 ч при 20С С, после чего промывают 0,1 И IiCE и водой. S

Сорбент содержит 2,2 мкмоль лиганда на 1 мл геля, П р - и ;и е р 6, Иммобилизация тнофенола па сефарозе.

100 мл сефарозы 48 (сухая масса

4 r) суспендируют в 150 мл 0,2 М карбонатнаго буфера рН 9,5. Добавляют 1 г ТТ, растворенного в диоксане, перемешивают 20 мин при 12 С. .Активированпую сефарозу фильтруют, лромывают Ое2 И карбонатным буфером . (рН 9,5). сразу же суспендируют в 100 мл такого же буфера и добавляют 0,5 г тиофенола, растворенного в этаноле. Смесь перемешивают 20

15 мин при 20 С, прОмывают вОЦОЙ, 50%-ным эганолом. Сорбент содержит

25 мкмоль фенильных остатков на

1 мл геля.

П р и и е р 7. Иммобилизация 25 амилосубтилипа Г10х на ноливинило" вом спирте.100 г водонерастворимого поливинилового спирта суспендируют в

1000 мл 0е1 И универсального буфера 3Q рН 8,0. охлаждают до 5 С и добав.о ляют 15 г ТТ, растворенного в диметиловом эфире этиленгликоляi AKTHBH рование проводят при перемешивании в течение 35 мин, после чего пре.парат фильтруют, промывают суспендируют в 600 мл О.е1 И фосфатного буфера рН б, добавляют к нему 400 мл раствора амилосубтилина Г10х .(содержание белка 4 мг/мл) и перемеши- 4в вают 6 ч при 10 С. Полученный про" дукт промывают 1 М раствором NaCE.

Полученный препарат обладает активностью 350 ед/г с содержанием белка

8,7 мг/г сухого продукта.

Предлагаемый способ позволяет провести активацию носителя в две стадии эа 30-100 мин, тогда как в известном способе содержится 7 стадий продолжительностью 190 мин.В то р же время свойства получаемых иммо.билизованных препаратов ие хуже чем в известном способе: при иммоби- . лизации ферментов на сефарозе содержание белка в готовом препарате по известному способу 8,.3-48,9 мг/г, а по предлагаемому методу 8,054,3 мг/г. Вместе с тем, сохраняется хорошая воспроизводимость результатов, что дает возможность получать препараты с заданными свойствами.

Себестоимость получения 1 л активированной сефарозы по предлагаемому способу составляет 53,35 руб (по известному — 116,7 руб. Для осуществления способа не требуется специального, оборудования, помещений, исключается .применение легко воспламеняющихся, токсичных и дорогих органических растворителей, которые заменяются водными растворами. Это приводит к обеспечению безопасности труда.

В случае, когда лиганд не подвергается нежелательному воздействию активатора, иммобилизацию можно проводить в той же реакционной смеси, в которой проводится активация, без отделения и промывания носителя,что сокращает число технологических операций и продолжительность процесса.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно упростить процесс получения иммобилизованных лигандов, так как при активации носителя число стадий уменьшается в 3 5 раза, а их продолжительность в 1,9-,6,3 раза, а также снижается стоимость целевого продукта.

Иммобилизованные препараты, полученные по предлагаемому способу, пригодны для использования в медицине, ветеринарии микробиологической промышленности, также в других отраслях народного хозяйства. В частности, иммобилизованные на целлюлозе протеазы могут быть использованы в медицине и ветеринарии для лечения гнойных заболеваний, а иммобилизованные полиамины, липопротеиды и тиофенол — в качестве сорбентов для аффинной и гидрофобнои хроматографии.