Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ (его варианты)
1. Биоспецифический полимерНьй адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель. связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного -носителя, связанного с ингибитором , сшитый сополимер овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хпорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакриламида, или N-винилпирролидона и бифункционального схци ающего агента , взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80-90,60 и 8,60-15,60 мас.%, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 4,2-13,0 мас.%, вода - остальное. 2. Биоспецифйческий полимерный адсорбент, содержащий полимерный носитель, связанный С белковым ингибитором протеиназ, и воду, отличающийся тем, что, с целью повьшения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного носителя, связанного с СО ингибитором, сшитый сополимер ofib мукоида из белка утиных яиц, ацилиоо , рованного хлорангидридом ненасыщен00 00 ной кислоты, акриламида, или метакриламида , или N-виниапирролидона и бифункционального сшивающего агента , взятых соответственно в количествах; 0,35-17,30, 55,20-90,55, 8,6041 ,40 мае. %, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 3,414 ,1 мае. %, вода остальное.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУВЛИН 4 (51
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3427499/28-13; 3427601/28-13 (22) 15.04.82 (46) 30.01.85. Бюл. ¹ 4 (72) Н.А.Платэ, Л.И.Валуев, И.А.Маклакова, В.В.Чупов, Т.А.Валуева, В.B.Мосолов, В.Г.Акопян, В.Т.Кондаков и В.В.Щербачев (71) МГУ им. М.В.Ломоносова, Институт биохимии им. A.Н.Баха и Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей (53) 577.15(088;8) (56) 1. Liepnieks ?.J., Light А.
Preparation of P-Trypsin by А1:йinity Chromatography of Entегоkinose—
Activa .:4 Bovinå Trypsinigen.—
"Апа1усЬ aI Biochemistry" 1974, ч. 60, р. 395-404,.
2. GiIliam Е.В., Kitto G.Â.
Isolation of starfish trypsin by аЕКinity chromatography. — "Сошрагаtive Biochemistry and Physiology", 1976, v. 54, р. 21-26.
3. Иульгин N.H., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом афинной хроматографии на трипсич-сефарозе. — "Биохимия", т. 46, № 3, с. 473-480. ! (54) БИОСПЕЦИФИЧЕСКИИ ПОЛИМЕРНЫЙ
АДСОРБЕНТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ (КГО ВАРИАНТЫ) . (57) i. Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель, „.Я0„, 1137388 А связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью новышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного .носителя, связанного с ингибитором, сшитый сополимер овомукоиpà из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакрил-амида, или М-винилпирролидона и бифункционального сшивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80-90,60 и 8,60-15,60 мас.Х> при содержании указанного сополимера в адсорбенте ф
4,2-13,0 мас.Ж, вода — остайьное.
2. Биоспецифйческий полимерный
Ф адсорбент, содержащий полимерный носитель, связанный с белковым инги битором протеиназ,. и воду, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного носителя, связанного с ингнбитором, сшитый сополимер DA)мукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида, или метакриламнда, или К-виниднирролидона и бифункционального сшивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-17,30, 55,20-90,55, 8,6041,40 иас. Ж, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 3,414, 1 мас. Ж, вода — остальное.
1137388
Изобретение относится к химии полимеров и биохимии, а именно к биоспецифическому полимерному адсор-, бенту для выделения протеиназ из биологических жидкостей, и может быть использовано для получения высокоочищенных препаратов протеиназ, а также для очистки биологических жидкостей от этих ферментов. Последнее необходимо для предотвращения ферментативного разрушения белковых веществ в процессе их выделения из объектов животного происхождения.
Для выделения протеиназ из биологических жипкостей известны биоспе/ цифические адсорбенты, содержащие полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду и получаемые активацией полимерного носителя - 20 сшитого полисахарида (сефарозы) бромцианом с последующим ковалентным присоединением к активированной сефарозе белкового ингибитора протеиназ (1 ).
Для этого к набухшей в воде сефарозе, содержащей 4-6Х твердого . полимера, при рН 11,0 добавляют бромциан. Полученную суспензию перемешивают в течение 8 мин, поддержи- 30 вая рН равным 10,8-1 1,2 добавлением
5 М раствора гидроокиси натрия. 3атем активированную сефарозу промывают водой и бикарбонатным буфером (pH = 9,5), и к ней добавляют раствор ингибитора. Суспензию перемеши-. вают 18 ч при 4 С, многократно промывают буферными растворами с рН
2,2 и 8,0 и непрореагировавшие группы активированной сефарозы нейтрали- 40 зуют раствором глицина.
Известен биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ из биологических жидкостей, 45 содержащий полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду.
В качестве полимерного носителя, концентрация Которого в адсорбенте 50 составляет 4 мас., адсорбент со;держит сшитый полисахарид сефарозу, а в качестве белкового ингибитора протеиназ — ингибитор трипсина из . сои. Концентрация ингибитора сос- 55 тавляет 25 мг/мл адсорбента. Адсорбент способен поглощать трипсин в количестве 5 мг/мп адсорбента 23.
Недостатками этого адсор бе нта являются невысокая эффективность адсорбента, составляющая 0,2 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, лабильность химических и биологических свойств адсорбента, который в качестве полимерного носителя содержит способный разрушаться под действием ферментов полисахарид — сефарозу, а также низкая гемосовместимость адсорбента. Последнее не позволяет использовать адсорбент для извлечения протеиназ из крови. Кровь при контакте с таким адсорбентом свертывается в течение
5-6 мин.
Наиболее близким к изобретению является биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду.
В качестве полимерного носителя, концентрация которого в адсорбенте составляет 4-6 мас.Х, адсорбент содержит сшитый полисахарид — сефарозу,а в качестве белкового ингибитора npof теиназ — ингибитор трипсина из лимской фасоли, Концентрация ингибитора составляет 5,4 мг/мл адсорбента. Адсорбент способен поглощать
1,6 мг трипсина/мл адсорбента (3 ).
Недостатками этого адсорбента являются невысокая эффективность адсорбента по протеиназам, составляющая 0,3 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, лабильность химических и биологических свойств ацсорбента, а также низкая гемосовместимость адсорбента. Время свертывания крови при контакте с таким адсорбентом составляет 5-6 мин.
Целью изобретения является повышение емкости адсорбента по протеиназам.
Поставленная цель достигается тем, что биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель, связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, в качестве колимерного носителя, связанного с ингибитором, содержит сшитый сополимер .овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакриламида, или -винилпирроли3 1 дона и биофункционального смешивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80
90,60 и 8,60-15 60 мас. 7 при содержании указанного сополимера в адсорбенте 4,2-13,0 мас.Х, водаостальное.
137388 нице между исходной концентрацией этих веществ н их концентрацией в промывных водах. Содержание полимера в адсорбенте определяют высушиванием адсорбента в вакууме при ком натной температуре до постоянного
;веса.
Кроме того, в качестве полимерного носителя, связанного с ингибито- 1р ром, адсорбент содержит сшитый сополимер овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида, или метакрнламида, или И-винилпирролидона и бифункционального сшиваю- щего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-17,30i. 55,2090,55, 8,60-41,40 мас. 7 при содержании указанного сополимера в . адсорбенте 3,4-14, 1 мас.Ж, вода— остальное.
Используемый овомукоид является гликопротеином с мол. массой около
22000. Его выделяют из белка утиных яиц по методике (3 3. Гепарин является мукополисахаридом, который применяют для предотвращения свертывания крови.
Биоспецифический адсорбент получа-ЗО ют раздельным ацилированием овомукоида и гепарина хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 6,0-8.0, температуре 0-30 С и мольным отношении овомукоид (гепа- 35 рин):хлорангидрид равном 1:10-100.
Затем полученные растворы смешивают и к ним добавляют акриламид, иетакриламид или N-винилпирролидон в количестве 7-20 мас. Х, бифункцио- 40 нальный сшиванщий агент, например
N,N -метипенбисакриламид или диэфир метакриловой кислоты, в количестве
0,7-15 мас. Х и инициатор радикальной полимеризации. Полученный раст- 45 вор вакуумируют или продувают инертным газом для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием раствора при О20 С в течение 10-20 мин. Получен- 50
D ный продукт измельчают до частиц- с размерами О, 1-1,0 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН 8,0 до полного удаления непрореагировавших соединений. Полноту удаления контро- 55 лируют спектрофотометрически..Количество связанного с полимером гепарина и овомукоида определяют по разЛля выделения протеиназ из биологических жидкостей адсорбент помещают в колонку объемом IO-50 мл, и через колонку пропускают жидкость. Количество адсорбированного фермента определяют по разнице между его исходной концентрацией в жидкости и конечной концентрацией или путем элюции адсорбированного фермента буферным раствором с рН 1,52,0. Промывание адсорбента указанным буфером обеспечивает полную элюцию фермента и многократное использование адсорбента. Гемосовместимость адсорбента оценивают по времени образования фибринового сгустка (тромбиновое время) при реакции фибриногена с тромбином в присутствии адсорбента или путем измерения времени свертывания крови при ее контакте. с адсорбентом.
Пример 1. В 80 мл бикароонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 100 мг овомукоида из белка утиных яиц. К раствору при 0 С добавляют 0,01 мл хлорангидрида акриловой кислоты, Реакционную смесь перемешивают при О С в течение 15 мин.
В 20 мп бикарбонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 20 мг гепарина, к раствору добавляют 0,003 мл хлорангидрида акриловой кислоты.
Раствор перемешивают при 4 С в течение 15 мин. Оба раствора смешивают и к ним добавляют 10 r акриламнда с
Э 1,0 г N,N -метиленбисакриламида и инициатор полимеризации — 0,01 r персульфата аммония и 0,2 мл
4X Horo pacTsopa N,N,N,N тетра метилэтилендиамина. Через раствор в течение 10 мин пропускают аргон для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием реакционной смеси при 10 С в течение 20 мин. После окончания полимериэации адсорбент, который представляет собой хорошо набухающий в воде полимерный гидрогель, измельчают и промывают бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений.
1137388
Свойства адсорбента приведены в табл. 1. Аналогичным образом получают адсорбент без гепарина, Свойства этого адсорбента также приведены в таблице. 5
П р и м.е р ы 2-4. Процесс получения адссрбента проводят по примеру 1, используя различные мономеры и сшивающие агенты. Состав исходной реакционной смеси и свойства адсорбентов приведены в табл. 1.
П р имер 5. В 10 мп бнкарбонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 10 мг овомукоида из утиных яиц, К раствору при О С добавляют 15
0,001 мл хлорангидрида акриловой кислоты. Реакционную смесь перемешивают при 0 С 15 мин. Затем к полученному раствору добавляют 1,0 г акриламида, О, 1 г N,N — метиленбисак- 20 риламида и инициатор полимеризации—
0,01 г персульфата аммония и 0,1 мл
0,47-ного раствора N,N,N И -тетра( метиленэтилендиамина. Через раствор в течение 5 мин пропускают аргон. 2Б о
Полимеризацию проводят прн 15 С в течение 10 мин. После окончания полимеризации адсорбент измельчают и промывают бикарбонатным буфером (рН = 8,0). Свойства адсорбента при- 3О ведены в табл, 2.
Пример ы 6-10. Процесс получения адсорбента проводят по примеру 5, используя различные мономеры и сшивающие аге:--ты. Состав исход- З ной реакционной смеси и свойства адсорбентов приведены в табл. 2.
В табл. 1 и 2 приняты следующие обозначения: ХААК вЂ” овомукоид,ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, ХАКК вЂ” овомукоид, ацилированный хлорангидридом метакриловой кислоты, AA — акриламид, ВП вЂ” N-винилпирролидон, MAA — метакриламид, БИС вЂ” N,N — метиленбисакриламид, ТГИ-13 — диэфир метакриловой кислоты и полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 13.
Таким образом, предлагаемый адсорбент обладает повышенной эффективностью. Так, емкость адсорбентапрототипа, который одновременно является базовым объектом, составляет 0,3 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора. Емкость адсорбента по изобретению составляет
0,8-1,0 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, т.е. этот адсорбент является в 3-4 раза более эффективным, чем адсорбент-прототип.
Повышенная эффективность адсорбента позволяет в 3-4 раза сократить расход наиболее дорогостоящего компонента адсорбента — белкового ингибитора протеиназ. Использование в качестве полимерного носителя синтетического полимера карбоцепного строения на основе легко доступных мономеров, кроме того повышает устойчивость адсорбента к деградации под действием кислот, щелочей и различных ферментных систем по сравнению с адсорбентом-прототипом, который является полисахаридом и содержит в основной цепи легко гидролизуемые связи углерод-кислород. Состав адсорбента, а следовательно, и набухаемость адсорбента, можно легко регулировать путем изменения состава исходной реакционной смеси. Изобретение характеризуется также доступностью и простотой выделения овомукоида из белка утиных яиц.
1137388
Ю
<4 ь
+I
Ю +I
ОО
СЧ о
+ o
С 1
+I ь
С5, С»
o z о Г
1 о
1 х х о о, о
О 1х х х ю
<б Х 1
1»
Я х
1»
Х
0)
Я1 ,Я
Ю л 0 а)
E» E
v x о е х ю
& х
1 х (U ф.
Ю =К
СО С»! М л л л
СЧ М М ф 1»
Ю и л
С»! ф
М
СЧ л
О1 л о
Е» о о о, о
СО
М л х
I х
I а
Е х
Ю Ь л л 1
ОО со 1
».
1
1 о л
М л,о о
cd
)»»
А х
1 о
Р с о » х х х
1» о о
I х
И
Г
С; х
Х !»
О Е
I о
М л
С4 л
Ю л
Ю»
Ж М
EQ I
»
1 I
Ю = С С
» I с»1 (Э ж
1 14
С4 о х
E о ф
С л
С4
Ф
X о х о
С0
Ю ! С 1
Ю
Ю
Г».И. И
;3. Я о
Ф
Е о
C х
tf 1 о
Х 1
u -!
Ж I
Ю а О г lA
С 4 С 4
Ю Ь Ю СО CO л л л
»» о о
Ch л о С»! л СЧ л л л
Ю С Ю o o o о
Д»
Г4 <б о е о
I Х Ц
Х (U
1 о
1-ХО
I Ю I:4 са о х
С4 V о
mx9
I E» Kl m о о
1 3 Х 5
1 и Х Х
1 йВЬ р, д о. ооо
Zu™Qv ! Ф
1137388
10 о с
1 ф !
0 !» О оахх
Х 1- Х
Ю Х Ф cd cd х Ф е» ю
I-ЮХО8
ХОФФ&
Фоххх
gu О,qc0
Fl 5 & c0 !»
)1
I
1 !
О ф
I !
- о л
1 х
Ф Ф ф ф 1< Яс
Ю л м
& 1-1
Ф Ф
О Е В; л
Ш E E
3х х Ф3 о х м
1 cd I.Ý Ф
E I I E хФ ц О
1о! оо
О 1 t» Х
О !
О
Ф
1» Ц
1 1 Х а о
О 1 О
1 В
1 Ю
I Е
I Х
1 Ф
1 С»
1 Ф
cd
С4 о
Е
& Ж о
И1ф
v v ж ж
Kl FCI о ц ж ж
FCI Kl о о о
v 1
Ь вЂ” — — — »
g!
X ь
С
Г-ю л
А о
1 о
1 К
I Х о о
I й
1 О
X о
Ф х и о
Х
4 о л л о оо о oo oo л л л о — о о
I 1с 4с
4С М 31 о о л r- м л л л о сч an м>
Г1 Г1 м iM !. о
Ф 00
4О Ч С а л л л л л л о сч л м и л л 1Г л о сч»»» о î о
Cl л л л о о
СЧ СМ и о а в л л л л о
1 а О I 1 I о л II о о х х х о, Й х х х йиi О. Р. g4 о о о ф 31