Способ а. л. ямпольского определения с-реактивного белка в крови

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Кл, 42!, 3/54

Заявлено 06.Х1.1958 (№ 611341/31) с присоедш епием заявки ¹

Приоритет

Опубликовано 31 V.1967. Бюллетень № 12

Дата опубликования описания 7ХП1.1967

МПК G 01п

УДК 615.47:612.118.221

Комитет пе делам кзооретвний и открытий при Совете йтиннстров

СССР

Автор изобретения

А. Л. Ямпольский

Заявитель

СПОСОБ А. Л. ЯМПОЛЬСКОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА В КРОВИ

Предлагаемый способ определения С-реактивного белка в крови дает возможность улучшения диагностики заболеваний с наличием воспалительных и некротических явлений.

Отличительная особенность способа заключается в том, что С-реактивный белок определяют с помощью иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов внутривенно раствором С-реактивного белка, выделенного нз плевральпого (или перитонеального) экссудата больных лимфогранулематозом с использованием для его изоляции СХполисахарида.

Для микроопределения С-реактивного белка предусматривается применение капиллярной реакции преципитации с использованием набора, содержащего микроцентрифугу Шкляра на два гнезда, капилляры со штативом для них, микропробирки для центрифуги и штатив к ним, иглу и флакончик с иммунной сывороткой.

Способ осуществляется следующим образом.

Плевральный или пернтонеальный экссудат от больного лимфогранулсматозом проверяют

13 реакции кольценреципитации с растворохт

СХ-полисахарида 1:100000. В качестве контроля употребляют тот же экссудат, в который предварительно добавляют 2 — 3 капли 0,1 М раствора цитрата натрия на 1 лл экссудата и тот же раствор СХ-полисахарида. Если в опыте образуется преципитат, а в контроле он»е образуется, то экссудат можно брать в работу. 2 л экссудата, положительно реагирующего с СХ-полисахаридом, оставляют в холодильнике на 2 дня при 2 — 8"С. Выпавший в осадок фибрин удаляют центрифугированием.

Добавляют 1 л водопроводной воды и хорошо высушенный сульфат аммония по 313 г на 1 л разведенного экссудата. Хорошо перемешивают и, спустя несколько минут после полного растворения, осадок удаляют фильтрацией через несколько буман(ных пли полотняных фильтров.

На каждый литр фильтрата добавляют по

175 г сульфата аммония и через несколько минут после растворения выпавший осадок отфильтровывают на бумажные диски в воронках Бюхнера с прокладками из бумажной массы с помощью водоструйного насоса. Лепешки альбумннов снимают с бумаги ножом и растворяют в ми пгмальном объеме дистиллироганной воды. Раствор освобождают от груоы. обрывков бумаги фильтрацией через ват1 о-марлевый фильтр, который хорошо отжимают. и еще раз фильтруют через фарфоровуго сьсчу.

Ультрафнльтрат помещают в стерильный целлофановый мешок и подвергают днализу в

30 течение 48 гас в 4 л 0,01%-ного хлористого

126228 калия. Выпавший в мешке осадок выделяют центрифугированием и растворяют в 50—

100 мл 0,1 М раствора цитрата натрия.

Охлажденный раствор помещают в колбу, добавляют равное ему количество охлажденного хлороформа, погружают колбу наполовину в сосуд с мелко наколотым льдом, осторожно встряхивают 15 мин в шюттель-аппарате и центрифугируют.

В центрифужных пробирках смесь разделяется на 3 фазы: солевую верхнюю, гелеобразную среднюю и хлороформную нижнюю. Отсасывают верхнюю солевую фазу и снова добавляют в колбу равное ей количество хлороформа. Повторяют процедуру встряхивания и отсасывания. Наслаивают солевую фазу на равное количество хлороформа и оставляют в холодильнике на 18 час. Смесь центрифугируют и отсасывают солевую фазу, которую затем подвергают диализу в течение 18 час в растворе 0,85%-ной поваренной соли и 0,01%ного хлористого кальция. В диализующемся растворе (в мешке) осадок не должен образовываться.

К раствору добавляют СХ-полисахарид, предварительно растворенный в небольшом объеме физиологического раствора (до финальной концентрации 0,15 мг/ял), и помещают его в термостат при 37=C на 2 час, а затем в холодильник на 12 — 18 час. После этого раствор центрифугируют. Осадок промывают три раза раствором 0,85%-ной поваренной соли и 0,01%-ного хлористого кальция, каждый раз разрыхляя стеклянной палочкой, Промытый осадок растворяют в 10 — 15 мл

0,1 М раствора цитрата натрия. Малые количества нерастворимого материала (если таковой будет) удаляют центрифугированием.

Последний раствор содержит очищенный

С-реактивный белок и может употребляться для иммунизации. Концентрацию С-реактивного белка в растворе определяют следующим образом: сначала в небольшом объеме раствора (0,2 мл) опредечяют азот по Кьельдалю, а затем полученную величину его в миллиграммах умножают на коэффициент 7,81.

Целесообразно иммунизировать одновременно нескольких кроликов (8 — 12) весом от

3 до 4,5 кг, которым вводят внутривенно по

1 — 1,5 мл раствора С-реактивного белка от

0,5 до 0,75 мг белка при каждой инъекции.

Одновременно с первым внутренним введением кролику в несколько симметричных мест под кожу живота вводят 2 — 3,5 мл полезной эмульсии, содержащей 1 мг С-реактивного белка. Через 7 дней после последнего внутривенного введения антигена кролики тотально обескровливаются из сонной артерии. Сыворотку консервируют мертиолатом 1:10000 и оставляют в холодильнике на 1 — 2 недели, после чего центрифугируют для удаления выпавшего осадка и сливают в одну посуду до окончания проверки.

Проверку иммунной сыворотки производят путем определения максимальной преципитиПредмет изобретения

1. Способ определения С-реактивного белка в крови, отличающийся тем, что, в целях улучшения диагностики заболеваний с наличием воспалительных и некротических явлений, С-реактивный белок определяют с помощью иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов внутривенно раствором

С-реактивного белка, выделенного из плевр ального (или перитонеального) экссудата больных лимфогранулематозом с использованием для его изоляции СХ-полисахарида.

2. Применение по способу 1 капиллярной реакции преципитации с использованием набора для микроопределения С-реактивно го белка, состоящего из микроцентрифуги Шкля65 рующей силы и титра, для чего из раствора

С-реактивного белка готовят объемные растворы, чтобы иметь следующие его концентрации в мг/мл: 0,3; 0,1; 0,03; 0,01; 0,001. Реакции преципитации ставят в капиллярах. Максимальной преципитирующей силой сыворотки будет то наибольшее количество преципитата в капилляре в миллиметрах, которое образуется в эквивалентной зоне при концентра10 цип С-реактивного белка от 0,1 до 0,03 мг/иг.

Допустимой максимальной преципитирующей силой должны считаться пределы от 4 до 8мм.

Для проверки на отсутствие перекрестных реакций с сыворотками здоровых людей за15 готовляют лиофилизированную сыворотку от

20 доноров, у которых в день взятия крови измеряют температуру, определяют РОЭ, лейкоцитоз и лейкоцитарную формулу. При наличии любых жалоб на недомогание, повышения

20 температуры или изменения крови доноры от взягия крови отстраняются. В дальнейшем при наличии проверенной иммунной сыворотки против С-реактивного белка, реакция сыворотки донора с ней также должна учиты25 ваться.

Лиофильная сушка сыворотки здорового донора должна производиться не позже, чем на следующий день после взятия крови. Для постановки реакции лиофилизированные сыво50 ротки разводятся в день исследования и 20 контрольных реакций преципитации с иммунной сывороткой против С-реактивного белка ставятся в капиллярах. При отсутствии положительных реакций сыворотка признается год55 ной к употреблению и разливается во флакончики по 1 мл и снабжается этикеткой: иммунная сыворотка против С-реактивного белка.

Титр, дата, серия.

Если имеется хотя бы одна положительная

40 реакция, целесообразно добавление в общий объем BHTHcbIBOpOTfiH сухой нормальной сыворотки по 0,05 г на 1 мл. После экспозиции в термостате при 40 С в течение двух суток антисыворотка освобождается от выпавшего

45 преципитата центрифугированием на больших оборотах, после чего разливается во флаконы. т26228

Iзедактор T. Н. Карапова Техред T. П. Курилко Корректоры: Е. Ф. Полиоиова и Е. Н. Гудэоаа

Заказ 2382/14 Тираж 535 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4

Типография, пр. Сапунова, 2 ра на два гнезда, капилляров, штатива для капилляров, микропробирок для центрифуги, штатива к ним, иглы и флакончика с иммунной сывороткой.