Способ определения мембранотропной активности полиеновых антибиотиков

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМЪГ СВИДЕТЕЛЬСВ ВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3516981/28-14 (22) 02.11,82 (46) 07.05.86, Бюл. Ф 17 (71) Биологический центр АН АЗССР (72) Х.М.А.Касумов и О.К.Малафриев (53) 616,07 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 972400, кл. G 01 N 33/48,1980, (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕМБРАНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИЕНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ, включающий формирование бислойной липидной мембраны на отверстии в тефлоновой ячейке, распредеЛК„1229692 А 1 ляющем водно-солевые растворы, введение в раствор исследуемого антибиотика и измерение электропроводимости мембраны, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и специфичности способа, дополнительно определяют динамику времени релаксации потенциала мембраны, вычисляют постоянную времени релаксации и при увеличении электропроводимости мемб" раны более чем на ЗОБ и повышении постоянной времени релаксации в сравнении

I с,исходным определяют мембранную активность антибиотика.

1229б92

Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использовано в фармакологии, микробиологии и экспериментальной медицине.

Цель изобретения — повышение точности оценки биологической эффективности при моделировании биологического действия мембранотропного вещества на искусственной бимолекулярной липидной мембране (БЛМ).

Способ осуществляется следующим образам.

Формируют бислойную липидную мембрану на отверстии в тефлоновой ячейке, разделяющем водно-солевые растворы, вводят в нее исследуемое вещество и измеряют индуцированную проводимость. После достижения стационарной проводимости отмывают исследуемое вещество из одного из растворов, регистрируют кинетику релаксации проводимости, определяют постоянную времени релаксации и по ее величине определяют эффективность исследуемого вещества in vivo.

Пример. Измерение электрических характеристик мембраны проводят в режиме фиксации потенциала с помощью усилителя 45-9, Напряжение Ue„ oò источника регулируемого напряжения подается через электрод на мембрану, Ток через мембрану подается через экранированный

1электрод на вход злектрометрического усилителя, где преобразуется в сигнал выходного напряжения Пщщ.

Ток вычисляется по формуле навьи т

Rîñ где R — сопротивление обратной связи.

Удельная проводимость вычисляется по формуле

Пеь х

g йй

Цвх где S — площадь мембраны, Сигнал выходного напряжения усилителя подается на самописец и регистрируется на диаграммной ленте, Четырехканальный перистальтический насос подает по трубке отмывочный раствор, содержащий сахарозу, ко дну стеклянной кюветы (объем 12 мл), Пегкий исходный раствор отсасывается сверху.

В результате происходит замена исходного раствора с антибиотиком раство— ром, не содержащим антибиотик. При этом условия в тефлоновой,ячейке (объем 1 мл) неизменны. После прохаж5

1 0

Щ

25 eO

ЭЯ

40 1 дения границы раздела растворов через мембрану концентрация антибиотика во внешнем (отмываемом) растворе скачком падает до нуля. Момент прохождения фиксируется визуально, так как растворы имеют разную плотность и разный показатель преломления„ Если подавать тяжелый атмывочный раствор сверху, то происходит перемешивание растворов, концентрация антибиотика вблизи мембраны меняется сложным нерегулярным образом, чта приводит к искажению кинетики релаксации и неопределенности с.

Состав мембраны фосфолипиды/холестерин = 0,5. Солевой раствор 10 мм

КС1„ рН 6, t = 23 С. Вводят 1,7 10 метамфоцина. После достижения стационарной проводимости отмывают внешнюю сторону мембраны раствором 10 мм KCl +

+ 10% сахарозы.

Мембрану формируют следующим образом,, На отверстие вымытой и высушенной ячейки наносят каплю липидного раствора и высушивают. Это необходимо для лучшего сцепления мембраны с краями отверстия. Затем ячейку вставляют в стеклянную кювету, заливают солевы<ми растворами и пад контролем в микроскоп (МСС2) из пипетки, смоченной липидным раствором, выдувают на отверстии пузырек воздуха. Первоначально липидная пленка на отверстии имеет значительную толщину и на ней в отраженном свете в микроскоп видна интерференционная картина (Кольца Ньютона.). По мере утаньшения пленки (растекания) ее толщина становится меньше длины волны, и интерференционная ,картина исчезает. Из маточного раствора антибиотика 10 М в ДМСО или дистиллированной воде вводят в солввые растворы в требуемом количестве микрошприцом и перемешивают магнитной мешалкой, Регистрируют кинетику проводимости и после достижения ее стационарного уровня gs производят отмывку. Момент начала отмывки регист"рируют визуально в микроскоп. Регистрируют кинетику релаксации проводимости н строят график в координатах

1g g/gs t, причем началу отсчета времени соответствует момент начала отмывки.

Для определения с на линейном участке графика могут быть выбраны произвольные моменты времени

229

Для сравнения эффективности различных антибиотиков для мембран состава холестерин/фосфолипиды 0,5 и концентраций амфотерицина Ви и его аналога АВ4 (условное название)

5 ° 10 М определяют с. >2 ч и 810 мин соответственно.

Составитель H.Êóçåíêîâà

Редактор А.Козориз Техред Л.Олейник Корректор А.Ференц

Заказ 2446/45 Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 н, t = 24 мин, t = 30 мин, 1g g,/g = 0,84 взяты .ля конкретного варианта расчета.

Как известно из аналитической геометрии, уравнение прямой у=ах + Ъ, 5 где а — тангенс угла наклона прямой.

Пусть заданы две точки прямой

7q) (х, у ) °

Тогда у = ах, + у ах +Ь

2 7 откуда у у х — x а = 1/- 2 °

1 х -х, у -у, Релаксация проводимости описывает15 ся уравнением

g = k.gs1 !" или

1g g/gs 1gk — t/c., т. е. получают линейную зависимость с угловым коэфициентом — 1 L

Отсюда и следует формула для определения 7: л Е2 tg

С = 25

2,3 1g g,/g, Величину 1g g>/g = 0,84 получают из

692 4 графика 1g g(t)/gs при t< 24 мин, — 30 мин.

От сюд а пол уч ают

30 — 24 — = 3 мин.

2,3 0,84

Таким же образом по кинетическим кривым определяются все остальные значения Г.

Повторяют указанную процедуру в

-7 диапазоне концентраций 5-10 -3 10 М.

Для сравнения эффективности анти биотнка мембраны животных клеток мо делируют составом холестерин/фосфолипиды в весовом соотношении l:2, а клетки грибов — эргостерин/фосфолипиды 1:20. При этом получают t -1,5 мин и ) 30 мин при концентрации метам. фоцина 10 М.