Способ получения 7-замещенных 9а-метоксимитозана

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО14ИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК сЮ 4 С 07 D 487 14

scarp ;,„,„

13,", 1

ВИБЛМОИМ4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

R Ri2

5 М-С-0Ц и ОЦ, Ia®L

hO

Сл

С0 2

i %Ф с=

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3607001/23-04 (22) 03.06.83 (31) 385149 (32) 04.06.82 (33) US (46) 15.08.86. Бюл. У 30 (71) Бристоль-Мейерз Компани (US) (72) Долатрай Моханлал Виас (СА), Такуси Канеко (JF) и Терренс Вильям

Дойле (СА) (53) 547.759 5.07(088.8) (56) Патент С1ПА М 3121084, кл. 260-268, 1964.

Abdulla R.F. et а11. The Chemistry of Formamide Acetals. Fetrehedron, 1979, v. 35, р. 1720-24. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-ЗАМЕШЕННКХ 9а-МЕТОКСИМИТОЗАНА общей формулы 0

II

СИ2ОС-В

А

0СИЗ

Э N R где А — амико, метокси или группа общей формулы

Иг 3 4 -С =М—

В или оба А и  — амидиновая группа общей формулы

Вг

R3R4Х С=И

SU„„51806 A 3 форм

R — водород или метил;

R u R — каждый в отдельности метил

3 4 или изопропкп, или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперидин или морфолин, отличающийся тем, что митомицин С, или митомицин А, или их

N -низший алкил производное подвергают взаимодействию с амидоацеталем обией формулы где R R u R тлеют указанные зна2 3 4 чения;

R — метил или этил, 5 в безводной совместимой с реакцией жидкой органической реакционной среде, выбранной иэ хлороформа, метанола, хлористого метилена или смеси хлороформа и метанола, при 50-65 С до получения соединения, где В или оба А и В представляют собой амиди новую группу общей формулы где R R u R имеют укаэанные значения.

1251 8

Изобретение относится к способам получения новых производных митомицина С, а именно 7-замешенных 9аметоксимитозана общей формулы

0СН3

5— - Ri

1) lO где А — амино, метокси или группа общей формулы

В или оба А и  — амидиновая группа общей формулы водород, формил или метил;

R — водород или метил;

R u R — каждый в отдельности метил

3 4 или изопропил, или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперидин или морфолин, обладающих противоопухолевой активностью, Целью изобретения является получение новых соединений, обладающих ценными фармакологическими свойствами с повьппенной активностью.

Пример 1. 7-((Диметиламино)ме1О тилен)амино-N -(диметиламино)-метилен-9а-метоксимитозан (соединение 1).

7-((Диметиламино)метилен)амино40

to

-N -(диметиламино)-метилен-формил-9а-метоксимитозан (соединение II).

К суспензии 500 мг (1,50 MM) митомицина С в 25 мл хлороформа добавляют в целом 9,6 мл (2,4 мл порциями че45 рез О, 18, 21 и 23 ч) N N-диметилформамиддиметилацеталя и суспенэию перемешивают при 50 С в течение 41 ч.

После выпаривания растворителя и избытка реагента при пониженном давлении получают темно-зеленый остаток;

ТСХ (хлористый метилен/метанол 20:I) показывает отсутствие митомицина С при наличии двух новых зеленых компонентов (Rf=0,16 и 0,22). Основной компонент (Rf= О, 16) выделяют хроматографией мгновенного испарения, используя смесь хлористый метилен/ме06 2 танол 20:1 в качестве элюента, в виде зеленого твердого вещества (340 мг, 51,5Z), который после растворения в диэтиловом эфире с последующим добавлением гексана дает соединение 1 в виде темно-зеленого аморфного порошка.

Вычислено, : С 56,71; Н 6,08;

N 18,90

Найдено, Е: С 56,20; Н 6,28;

N 17,88.

Второстепенный компонент (Rf=

=0,22) выделяют (180 мг, 25,35X) в виде аморфного твердого вещества, которое после осаждения из диэтилового эфира и гексана идентифицируют как соединение II.

Вычислено, 7.: С 55,89; Н 5,93;

N 17,78

Найдено, 7.: С 55,41; Н 5,96;

N 16,99.

В растворах соединений и II либо в этилацетате, либо в N,N-диме1гилформамиддиметилацетале при стоянии при комнатной температуре более

l0 ч происходит превращение соединения 11 (Rf=0,22) в соединение 1 (Rf=0,16), что удостоверяется ТСХ, с получением раствора с повьппенным содержанием соединения I.

Примеры 2-7 выполняют согласно примеру 1 с модификациями, указанными ниже, с получением различных дополнительных соединений.

Пример 2. 7-((Диизопропил1О амино)метилен)амино-N -(диизопропиламино)метилен-9а-метоксимитозан (соединение 11!).

Суспенэию митомицина С (200 мг, 0,6 мМ) в N,N-диизопропилформамидпиэтилацетале (3 мл) нагревают при перемешивании в течение 15 ч при

53 С. Реакционную смесь выливают в

50 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 30 мл). Объединенный органический экстракт сушат (Na SO ) и вы2 паривают с получением темно-зеленого сиропа; ТСХ (хлористый метилен/метанол 10:1) показывает наличие основного зеленого компонента с Rf=0,43 и примесей, движущихся быстрее (Rf=

=0,45-0,50). Основной компонент 111 вьщеляют в виде темно-зеленого твердого вещества (156 мг, 46,87) с помощью двукратной хроматографии мгновенного испарения с использованием

251806

15

25

3 1 смеси хлористый метилен/метанол 20:I в качестве элюента.

Вычислено, 7: С 62,55; Н 7,91;

N I5,!0

С «1, «!О

29 4д s 5

Найдено, 7: С 62,08; Н 7,80;

И 14,60.

Пример 3. 7-((Диметиламино) (о метилен3амино-И -(диметиламино)мети(о лен-9а-метокси-11 -метилмитозан (соединение ZV).

1о

Порфиромицин (N -метилмитомицин С

130 мг, 0,37 мМ) замещают в качестве исходного соединения в реакции с

0,8 мл (1,5 мМ) N,N-диметилформамиддиметилацеталя, используя 10 мл хлороформа и 2 мл метанола в качестве реакционного растворителя, время реакции 50 мин при 50 С. Соединение

IV получают в виде сиропа после выпаривания реакционного растворителя.

Это соединение затем очищают хроматографией мгновенного испарения, используя 20 г силикагеля и смесь хлористый метилен/метанол 20:1 в качестве элюента.

Вычислено, 7: С 57,60; Н 6,55;

N 18,33

Найдено, 7,: С 57,11; Н 6,11;

N 17,99 °

Эта методика дает соединение

% ю

V — 7-амино-N -диметиламинометилен,1О

-9а-метокси-N -метилмитозан — в качестве побочного продукта с 307-ным !

5 выходом; ТСХ: Rf =0,40 (хлористый метилен/метанол 9:1).

Вычислено, 7.: С 56,53; Н 6,20;

N l7,38

Сюэ «1 И 0

Найдено, 7.: С 54,68; Н 6,13;

N l6,59.

Пример 4. 9а-Метокси-7-j(I—

-пиперидиниламино)метилен)амино-N (I-пиперидинилметилен)митозан (сое45 динение VZ) .

N-(Диэтоксиметил)пиперидин (3 мл) и митомицин С (200 мг) взаимодействуют при 60 С в течение 2,5 ч в хлороформе(3 мл). Продукт получают с

27,67.-ным выходом, ТСХ: Rf =0,20 (хлористый метилен/метанол 20:1). ч

И -Формил-производное предыдущего вещества.

1((N -Формил-9а-метокси-7- 1(1 -пи(Р перидиниламино ) метилен ) -амино- 1ч (1-пиперидинилметилен ) митозан получают в качестве основного компонента: выход 437; ТСХ: Rf =-0,25 (хлористый метилен/метанол 20:!).

Вычислено, 7.: С 60,08; Н 6,32.

N )5,21

С Н N О яя зв в б

Найдено, 7.: С 59, 09; Н 6, 1 7;

N 15,07

Пример 5.,9а-Метокси- 1(!— морфолино)метииен1амино-И "-(1-морфолино)метилен мптозан (соединение (Т(! ).

Перемешнваемую суспензню митомицина С (200 мг, 0,6 мМ) в хлороформе (10 мл) и И-днэтоксиметилморфолина

<4 мл) нагревают при 53 С в течение

42 ч. Реакционную смесь концентрируют до консистенции сиропа под высоким вакуумом. С помощью сырой хроматографии мгновенного испарения (хлористый метилен/метанол 25:I) отделяют зеленые компоненты от избытка реагентов. Объединенные зеленые реагенты растворяют н 20 мл этилацетата и промывают водой (3 20 мл). Объединенные промывки реэкстрагируют этилацетатом (3"15 мл).

Все этилацетатные фракции объединя— ют, сушат (Nn, (-.Г ) и выпаривают до темно-зеленого сиропа; ТСХ (хлористь1й метилен/метанол 10:1) которого свидетельствует о наличии отдельного компонента с Rf =0,33 и нескольких зеленых примесей (Rf 0,35 — 0,40).

С помощью хроматографии мгновенного испарения компонент с R1 =0,33 выделяют (130 мг, 56,87) в виде темнозеленого аморфного твердого вещества, которое характеризуется как соединение VTI.

Вычислено, 7: С 56,78; H 6,06;

N 15,90

Найдено, 7: С 53,07; Н 6,03;

N 15,37, (е

Пример 6. 7-Амино-" .-диметиламннометилен-9а-метоксимитозан (соединение VT1I).

Вычислено, 7.: С 61,79; H 6,87;

N I6,02

С„Н„«1, С

Найдено, 7: С 61,01; Н 6,85;

N 15,34.

Митомицин С (200 мг, 0,6 мМ) растворяют в 10 мл хлороформа и 2 мл метанола, добавляют И,«:-днметилформамиддпметилацеталь (0,64 мл, 4,8 мМ) и раствор перемешивают прн - 50 С в

1251806

Найдено, 7: С 56,5); Н 5,92;

N 13,7).

1а

N -Формил-производное соединения

1Х получают в ниде соединения TXa111

-7,9а-диметокси-N -диметиламинометилен-N -формипмитоэана с выходом

)6,5 . ТСХ ))Г=О,Ь) (хлористый метилен/метанол 9:1).

Пример 8. 7- )1-(ДиметиламиIO но)этилиден7амино-11 — () (äèìåòèëI амнно)этилиден)-9а — метоксимитозан (соединение Х).

Суспензию (600 мг, 1,79 ммоль)

1итомицина С в 2 мл метанола обратечение 50 мин. Тонкослойная хромато) рафия (хлористый метилен/метанол

90:10) показынает следы непрореагировавшего митомицина С (Rf=0,22) и два новых компонента (Rf=0,42 и

0,33 соответственно). Раствор концентрируют при пониженном давлении до консистенции сиропа, который подвергают хроматографии мгновенного испарения (25 г силикагеля), используя смесь хлористьп) метилен/метанол

30:l в качестве элюента.

Быстрый компонент (Rf=0,42) вьщеляют в виде зеленого аморфного твердого вещества (60 мг, 22,57.) и идентифицируют как соединение 1 с помощью его ЯМР-спектра (пиридин Й ).

Основной синий компонент (Rf=0,33) вьщеляют в виде аморфного твердого 20 вещества ()48 мг, 63,37) и характеризуют как соединение VIII. Аналитический образец получают осаждением иэ хлористого метилена и н-пентана.

Вычислено, 7.: С 55,48; Н 5,9); 25

N 17,98;

С„Н „)),О

Найдено, 7: С 54,70; Н 6,)4;

N 17,95

Л р и м е р 7. 7,9а-диметокси, 1О

-N -диметиламинометиленмитозан (соединение IX).

Вместо митомицина С примера 1 берут митомицин А (170 мг) и подвергают взаимодействию с N N-диметилформамидЭ

35 диметилацеталем (0,6 мл) в растворе хлороформ/метанол 10:! при 50 С в течение 1 ч. Целеной продукт получают с выходом 48%; ТСХ: Rf=0,50 (смесь хлористый метилен/метанол

9:1).

Вычислено, 7: С 56,39; Н 5,94;

13,85 батывают 3 мл 11,N-диметилацетамиддиметилацеталя. Затем суспенэию нагревают до 75-80 С и перемешивают в течение 2 ч. На этой стадии ТСХ (хлористый метилен/метанол 10:1) показывает, что почти весь митомицин С израсходован в процессе реакции. На хроматограмме полученный продукт проявляется в виде зеленой полосы. Растворитель и летучие нещества удаляют концентрированием реакционной смеси досуха при пониженном давлении с получением сиропа, который растворяют и хлористом метилене и наносят на колонку с

40 г силикагеля, после чего колонку элюируют 200 мл 17-ного метанола н хлористом метилене, 200 мл 27-ного метанола в хлористом метилене, и

400 мл 57.-ного метанола в хлористом метилене. Фракции, содержащие зеленую полосу, представляющую собой продукт, объединяют и концентрируют до аморфного твердого вещества весом

110 мг, выход 137.. Это вещество растворяют в 2 мл ацетона и осаждают из раствора добавлением гексана.

Продукт собирают фильтрацией.

Вычислено, 7.: С 58,46; Н 6,83;

N 17,79;

С, Н I)05

Найдено, 7.: С 58,89; Н 6,89;

N 17,64.

Пример 9. 7-Окси-N -диметиламинометилен-9а-метоксимитозан.

К раствору 20 мг 7-окси-9а-метоксимитозана в 3 мл хлористого метилена добавляют 1 мл диметилформамиддиметилацеталя и раствор перемешивают при 65"С в течение 30 мин.

Ход реакции контролируют ТСХ (хлорис тый метилен/метанол 10:1). Продукт возвращают концентрированием смеси при пониженном давлении и остаток хроматографируют на силикагеле с получением целевого соединения.

Противоопухолевая активность по отношению к P-388 Murine лейкемии.

В табл. 1 приведены результаты лабораторных исследований на СБГ

1 мышах-самках, которым ннутрибрюшинно имплантировали опухолевый прививочный материал, содержащий 10 асцитных клеток P-388 Murine лейкемии и

1 которым вводили различные дозы тестируемого соединения формулы 1 или митомицина С.

1251806

В табл. 2 представлены результаты исследования противоопухолевой активности при заражении мышей В 16 меланомой коричневой. Эксперименты

Соединения вводили путем внутрибрюшинной инъекции. На каждую дозу брали группу из шести мышей, которые получали одну доэ1 оединения в первый после заражения день. В каждую серию экспериментов включали группу из десяти мьппей, которым вводили физиологический раствор. Группы, обработанные митомицином С были включены

1 в качестве положительного контроля.

Для каждой группы мышей в течение

30 дн отмечали время выживания в днях, а в конце 30-дневного периода регистрировали число выживших особей.

Мышей взвешивали перед введением препарата и повторно на 6-й день. Изменение веса было принято в качестве меры токсичности вещества. В эксперимент брали мьпяей веcом 20 г каждая и потерю веса до 2 г не считали черезмерной. Результаты выражали в процентном отношении Т/С (1,геМе i/contго1), которое представляет собой отношение времени выживания гр ппы, обработанной препаратом, к вр:мани выживания контрольной группы, обработанной физиологическим раствором, которое было принято эа 1001. Животные, которым вводили физиологический раствор, обычно погибали не позднее девятого дня.

Максимальный эффект в приведенной ниже таблице выражен в процентном отношении Т/С; рядом дана доза, которая этот дефект вызывает ° Цифры в круглых скобках представляют собой значения, полученные при введении митомицина С в качестве положительного контропя в том же эксперименте.

Таким образом, может быть вычислена относительная активность соединений настоящего изобретения по сравнению с митомицином С. Минимальным эффектом считали 1257. Т/С. Минимально эффективной дозой, приведенной в таблице, является доза, вызывающая минимальный эффект (1257. Т/С). Две цифры, данные в каждом эксперименте в графе среднее изменение веса представляют собой соответственно среднее изменение веса мьппи при максимально эффективной и минимально эффективной дозах (! 6 день). проводили на ВРГ, мьппах, которым внутрибрюшинно инокулировали опухолевый имплантант. Протяженность эксперимента 60 дн. На каждую дозу тестируемого соединения брали группу из 10 мьппей и для каждой группы определяли время выживания. У контрольных животных, инокулированных так же, как и опытные животные, и инъекцированных растворителем беэ препарата, время выживания составляло

21 день. Отношение времени выживания опытных животных к времени выжиI вания контрольных (Т/С) испольэовали в качестве меры эффективности и для каждого тестируемого соединения определяли максимально эффективную и минимально эффективную дозы. За минимально эффективную дозу принимели -такую дозу, которая вызывала эффект 125Z Т/С. Для каждой дозы опытным животным внутрибрюшинно вводили тестируемое соединение на

1-й, 5-й и 9-й день. Среднее изменение веса в день, отмеченное при максимально эффективной и минимально эффективной дозах, использовали в качестве меры токсичности, Потеря веса в 2 r не считалась черезмерной.

Соединения исследовали на противоопухолевую активность по отношению к В 16 11urine меланоме при подкожном введении опухолевого имплантанта и внутривенном введении препарата. Гра" фиК введения препарата и значения времени вьпкивания (исследования проводили в течение 40 дн) определяли, как указано вьппе. На 12-й день ollределяли изменение веса. Максимально эффективная доза соединения была

l мг/кг. Эта доза вызывала эффект

156Х Т/С и прирост веса 1,5 r. В группы брали по шесть животных, и при этой дозе три мьппи выживали в течение всех 40 дней. Минимально эффективная доза была 0,25 мг/кг, при этой дозе на 12-й день изменение веса составило 1,0 r. Минимально эффективную дозу мгтомицина С не определяли.

В кратком токсикологическом исследовании группам из пяти белых

BDF> мышей внутрибрюшинно вводили однократную дозу соединения. В результате при оптимально эффективной дозе вводимого соединения не наблюдалось значительного уменьшения чис1251806

10 ла лимфоцитов. При этой дозе также не отмечалось значительного повышения азота мочевины крови (Hun) или сывороточной глютаматфосфотрансфераэы (БОРТ), что указывает на отсутствие неблагоприятного воздействия на функцию почек или печени, а также на то, что препарат не подавляет активности лимфоцитов.

Ввиду высокой противоопухолевой активности, выявленной в эксперименПодавление P-388 Murzne

Среднее изменение

Минимально эффек тивная доза,мг/кг веса

Максимальный эффект

Соединение (пример) Т/С, Е Доза,мг/кг веса веса, r

6,4(3,2) -1,9, -0,2

<0,2

311 (244) 1 (1) 1 83(272) 6;4(3,2)

233(244) 6,4(3,2) -1,О, +0,3

-0,1, +О, I

0,1 (0,2

l I (1 ) 25,6(3,2)

12,8(3,2)

25,6(3,2)

12,8(3,2)

12,8(3,2) — I,2, +0,2

0,8

I I I (2) -3,8, +0,7

-1,4, +0 2

-0,7, +0,8

0,2

ТЧ(3) 6,4

Ч(3) 0,2

ЧТ(4)

VII(5)

VIII(6) -2,1 нет

0,2

144(272) 6,4(3,2) -0,4, -0,3

3,2

0,8(3,2) -0,2, -0,3

144(272) IХ(7) 0,002

)67(272) 6,4(3,2) — l,0, +0,3

1Ха(7) 0,05

12,8(3,2) +0 2

- I, 2, 194 (319) 0,2Х(8) Таблица 2

Подавление В l б меланомы

Соединение (пример) Среднее изменение

Минимально эффективная доза, мг/кг веса веса, г

>298(256) 0,8(3,2)

)295(I98) 2,0(3,0) +0,5 -0,2(5)

-0,4 -0,4(6) (0,2

ЧТТ(5) <2,0

П р и м е ч а н и е: цифры в скобках представляют собой значения контроля с митомицином С.

141(224)

233(272)

144(272)

165(224) ,300(224) тах на животных, а также пониженной токсичности в сравнении в митомицином возможно использование соединений общей формулы 1 для подавления опухолевого роста у млекопитающих ° В этих целях они применяются системно (по всему организму) у млекопитающих имеющих опухоли, в

10 основном в нетоксичных противоопухолевых эффективных дозах.

Т а б л и ц а 1 лейкемии