Способ обнаружения антигенов энтеробактерий

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И)

Ai (51)4 А 61 К 39 02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕ Г СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3796039/28-14 (22) 26.09.84 (46) 30.11.86. Бюл. Ф 44 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней (72) M.Þ.Cóñëoâà и В.А,Шамардин (53) 615.373(088.8) (56) Авторское свидетельство ССГ

9 843953, 1981. (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ

ЭНТЕРОБАКТЕРИИ (57) Изобретение относится к медицине. Цель изобретения — повышение специфичности и чувствительности анализа антигенов энтеробактерий. Исследуемую пробу фекалий заливают раствором NaC1, эмульгируют, отмывают, прогревают и центрифугируют. Часть надосадочной жидкости отбирают для исследования с помощью реакции пассивной гемагглютинации. Оставшуюся часть эмульгируют и смешивают с равным объемом антисыворотки. После экспозиции пробу центрифугируют. Надосадок исследуют с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации.

14 2 ва — Шига и Ларди-Сакса) по извесгному и предлагаемому способам.

1273) Изобретение относится к медицине, в частности к серологической диагностике.

Цель изобретения — повьппение специфичности и чувствительности анализа антигена энтеробактерий в фекалиях с помощью эритроцитарных,циагностикумов.

Указанная цель достигается тем, что до кипячения исследуемый образец 10 трижды отмывают физиологическим раствором, затем образец кипятят, отделяют надосадок и используют,цля анализа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), а осгцок исследуют с антимикробными сыворотками в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Постановка РТПГА.по известному способу включает агглютинацию диагностикума антисывороткой в заранее подобранной (2-4 гемагглютинирующие единицы) и проконтролированной рабочей дозе, истощенной надосадком фекалий. 25

Использование отмытого осадка существенно повьппает специфичность и чувствительность РТПГА.

Для постановки РПГА по предлагаемому способу используют супернатант, 30 полученный путем центрифугирования предварительно отмытого, эмульгиро-. ванного и кипяченого осадка фекалий.

Это позволяет существенно повысить специфичность РПГА, а значит, и точность серологического анализа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Исследуемую пробу фекалий .заливают 0„85 -ным раствором NaCI (5-10 О объемов), эмульгируют и двух-трехкратно отмывают свежими порциями

0,85 %-ного раствора NaCI и прогревают в кипящей водяной бане в течение 60-90 мин, после чего центрифугируют. Часть надосадочной жидкости отбирают для исследования с помощью

РПГА., а оставшуюся часть эмул:ьгируют и смешивают с равным объемом антисыворотки в стандартном разведении. 50

После 30-60 мин экспозиции пробу центрифугируют и надосадок исследуют с помощью РТПГА.

По известному способу фекалии заливают 10 объемами 0,85 7-ного раствора NaCI, прогревают в кипящей водяной бане 60 мин, центрифугируют и исследуют надосадок с помощью РПГА и РТПГА.

По предлагаемому способу фекалии заливают произвольным объемом 0,85 ного раствора NaCI, эмульгируют (перемешивают стеклянной палочкой) и отмывают дважды свежими порциями

0,85 %-ного раствора NaCI путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 15 мин. После этого к осадку добавляют 5-кратный объем 0,85 %-ного раствора NaCI, эмульгируют, прогревают в кипящей водяной бане 60 мин и центрифугируют при 3500 об/мин

15 мин, Затем 0,5 мл супернатанта отбирают для исследования с помощью

РПГА, для чего в планшете микротитратора готовят 6 одинаковых рядов последовательных разведений супернатанта в объеме 0 05 мл на 0,85 %-ном растворе NaCI, содержащем 0,4 7 нормальной лошадиной сыворотки, рН 7,07,2, и вносят в каждый ряд определенный антигенный диагностикум в объеме

0 025 мл. Учет РПГА по обычной методике через 1,5-2 ч.

Остаток пробы эмульгируют, вносят в нее равный объем смеси шигеллезных сывороток 6 специфичностей (конечное разведение каждой сыворотки в неадсорбированной смеси 1:100, в адсорбированной смеси 1:25) и выдерживают

40 мин при комнатной температуре.

Затем пробы центрифугируют при

3500 об/мин в течение 15 мин, отбирают 0,5 мл супернатанта и исследуют с помощью РТПГА.

Для этого готовят в планшете микротитратора 6 одинаковых последовательно разведенных рядов супернатанта в объеме 0,05 мл на 0,85 7-ном растворе NaCI. Для постановки контроля к 0,5 мл исходной смеси сывороток добавляют равный объем 0,85 7ного раствора NaCI и готовят 6 рядов разведений смеси антисывороток. В каждый ряд (1 опытный и 1 контрольный) вносят по 0,025 мл определенного 0,5 7-ного антигенного диагностикума. Учет через 1,5-2 ч по обычной схеме для PTIIIA. Присутствие антигеПример. При обследовании больного на дизентерию проведен по- 55 иск в фекалиях антигенов шигелл 6 специфичностей (Флекснера, Зонне, Ньюкасла, Штуцера — Шмитца, Григорье114

Составитель Л.Падюков

Техред, Л. Сердюкова

Редактор И.Рыбченко

Корректор Е.Рошко

Заказ 6365/6

Тираж 660

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, >К-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1273 на устанавливают по степени истощения гомологичной антисыворотки.

В результате при обнаружении антигенов различных видов шигелл с помощью РПГА по известному способу идентифицировано 17 образцов (42 7), с помощью РТПГА — 14 образцов (34 X), по предлагаемому способу — 23 и 37 (56 и 90 X) соответственно.

Предлагаемый способ позволяет зна-10 чительно повысить специфичность анализа за счет удаления активных растворимых агентов и повысить чувствительность индикации для многоэтапных реакций (РТПГА). Предлагаемая модифи — 15 кация РТПГА, когда истощение сыворотки идет за счет суммы растворимого антигена и микробных клеток, присутствующих в осадке фекалий, позволила в ряде случаев превысить порог инди- 20 кации, характерный даже для антигенных диагностикумов и в целом повысить результативность серологического анализа.

Таким образом, предлагаемый спо- 25 соб обнаружения антигена с помощью эритроцитарных диагностикумов позволяет значительно повысить точность серологического анализа (на 15-607) за счет повышения специфичности (для

РПГА и РТПГА) и чувствительности (для РТПГА) индикации антигена. Значительные затраты времени на отмывание осадка фекалий (30-40 мин) компенсируются снижением затрат труда и времени на выбор и контроль доз антисыворотки для нейтрализации по известному способу (3-3,5 ч).

Формула изобретения

Способ обнаружения антигенов энтеробактерий путем исследования в реакции пассивной гемагглютинации супернатанта, полученного после кипячения образца фекалий и центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности анализа, до кипячения образец отмывают физиологическим раствором, а после отделения супернатанта осадок фекалий дополнительно исследуют в реакции торможения пассивной гемагглютинации антимикробными сыворотками.