Способ получения пептидов в виде кислотно-аддитивных солей

 

Изобретение касается пептидов, в частности их получения в виде кислотно-аддитивных солей общей формулы I X-Arg-Lys-Y, где X - Н, Сер; Y - Asp, Asp-Val, Asp-Val-NH, Asp- -Val-OCHg, Asn-Val, Asp-Ala, Asp-lie, Ala-Val, Glu-Val, Asu-Val, которые обладают иммунологической активностью -и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности среди пептидов были получены новые 1. Их синтез ведут ступенчатым наращиванием пептидной цепи , начиная с эфира С - концевой аминокислоты , методом активированных зфиров и методом смешаннЕлх ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитных групп каталитическим гидрогенолизом. Испытания 1 показьшают, что они обладают более широким спектром иммунорегулирующего действия при низкой токсичности, чем известные пептиды. 6 табл. g О) с to -ч ;о о со сн

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ю Ч 3

CO

4Р

САР

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРеТений и ОткРытий (21) 3454444/23-04 (22) 11.06.82 (31) 1755/81 (32) 12.06.81 (33) HU (46) 15.12.86. Бюл. К 46 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT (HU) ,(72) Лайош Кишфалуди, Олга Ньеки, Иштван Шен, Ласло Денеш, Юлиа Эмбер, Дьердь Хайош, Ласло Спорни и Бела

Сеиде (HU) (53) 547.964.4.07(088 ° 8) (56) Патент США М 4190646, кл. С 07 С 103/52, опублик. 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ В ВИДЕ КИСЛОТНО-АДДИТИВНЫХ СОЛЕЙ (57) Изобретение касается пептидов, в частности их получения в виде кис. лотно-аддитивных солей общей форму„,80 „„1277903 А 3 сЮ 4 С 07 К l/02, 5/04, А 61 К 37/02 лы I Х Argus-У, где Х вЂ” Н, Gep;

Y — Asp, Asp-Val, Asp-Val-МН, Asp-Val-ОСН, Asn-Val, Asp-Ala, Asp-lie, Alà-Val, Glu-Ча1, Asu-Val, которые обладают иммунологической активностью и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности среди пептидов были получены новые 1. Их синтез ведут ступенчатым наращиванием пептидной цепи, начиная с эфира С вЂ” концевой аминокислоты, методом активированных эфиров и методом смешанных ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитных групп каталитическим гидрогенолизом.

Испытания 1 показывают, что они обладают более широким спектром иммунорегулирующего действия при низкой токсичности, чем известные пептиды.

6 табл.

12779п3

Изобретение относится к способу получения новых пептидов общей формулы

Х-Arg-Lys-V в виде кислотно-аддитивных солей, 5 где Х вЂ” водород, Glp;

V-Asp, Asp-Val, Asp-Va1-N11„, AspVal-OMe, Asn-Va1, Asp-Ala, Asр-I1e, Ala-Val Gly-Val Asu-Va1 обладаюУ Э У

f0 щих иммуномодулирующей активностью, которые могут найти применение в эк- . спериментальной биологии и медицине.

Цель изобретения — способ получения новых пептидов, обладающих более

15 широким спектром иммунорегулирующего действия.

Принятые сокращения: Š— бензилоксикарбонил-; Вос — трет-бутилокси— карбонилил-; OBu - трет-бутилокси-;

Opfp — пентафторфенокси-; Asu — аминосукцинил-; OMe — метокси-; OBzl бензилокси-; ONB — 4-питробензилокси-группа; ДМФА — диметилформамид;

ТЭА — триэтиламин. 25

Температуру плавления определяют с помощью прибора Тоттоли фирмы Buchi (Швейцария). Гомогенность промежуточных и конечных соединений контролируют с помощью тонкослойной хро-30 матографии на пластинках с силикагелем фирмы Merck (ФРГ) в системах:

1 — этилацетат-(пиридин-уксусная кислота — вода, 20:6:11), 95:5;

2 — этилацетат — (пиридин-уксус35 ная кислота — вода, 20: 6: 11), 9: 1;

3 — этипацетат — (пиридин-уксусная кислота — вада, 20, 5: 1 1), 4: 1;

4 — этилацетат — (пиридин-уксусная кислота — вода, 20:6: 11), 3: 2; щ

i — н-бутанол — (пиридин-уксусная кислота — вода, 20:6:!1),, 3:7;

6 — хлороформ — метанол, 9:1;

7 — н-бутанол — уксусная кислота — вода, 1: 1: 1;

Я5

8 — н-бутанол — уксусная кислота — вода, 4." 1:5.

Хроматограммы проявляли нингидрином после хлорирования с К-толидином. Удельное оптическое вращение измеряли на цифровом фотоэлектрическом паляриметре Perkin-Elmer 141 (США). Растворители отгоняли на роторном испарителе фирмы (Швейцария) на водяной бане с температурой не выше 40 С.

Пример 1 (Метод А) . Z-.Arg (N0 )-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Val-ОЫВ (1) .

К раствору 1,73 г (6,0 ммоль) Val—

ONB НС1 в 15 мл ДМФЛ добавляют

0,84 мл (6,0 ммоль) триэтиламина и

2,45 г (5,0 ммоль) Вос-Asp-OPfp.

Реакционную смесь перемешивают

30 мин при комнатпой температуре, упаривают, остаток растворяют в 30 мл этилацетата. Раствор промывают 15 мл

l н. соляной кислоты, 15 мл 57-ного раствора бикарбоната натрия и 15 мл воды, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Полученный защищенный дипептид (R 0,9) растворяют в 10 мл 8 н. НС1 в диоксане, через 15 мин добавляют 40 мл безводного эфира и упаривают досуха.

Полученный в остатке свободный дипеп2 тид (R < 0,5) растворяют в 10 мл

ДМФА, доводят значение рН раствора с помощью триэтиламина до 8,0 и добавляют 3,1 r (5,5 ммоль) Boc-Lys/Z/ 0Pfp Реакционную смесь перемешивают 30 мин, поддерживая рН 8,0 с помощью триэтиламина, разбавляют

60 мл хлороформа и промывают 15 мп

1 н. соляной кислоты и 15 мл воды, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают, остаток упаривают с без-, водным эфиром. Полученный з ащищенный трипептид (R f 0,4) высаждают со

100 мл безводного эфира, отфильтровывают,. дважды промывают эфиром и растворяют в 20 мл ДМФА. К полученному раствору добавпяют триэтиламин до рН 8 О, а затем 3,3 г (7,0 ммоль)

Z.-Arg/N0z/-OP fp. Реакционную смесь перемешивают 30 МНН, поддерживают рН

8, О с помощью триэтиламина, упаривают, остаток растирают с 50 мл зтанола, отфильтровывают, промывают этанолом (2 ° 10 мп) . В итоге получают

3,85 г (73i) 1 с т. пл. 135-148 С;

R 0,80.

Пример 2 (метод Б). Z — Arg (NO ) — I.ys (Z) -Asp (OBzI) -OBzI (II) .

Смес.ь 1,62 г (3, 3 ммоль) Boc — Lys (Z) — OPfp, 1,40 г (4,0 ммоль) Asp (0BzI) 0BzI. НС1 и 0 98 мл (7 0 ммоль) триэтиламина в 1С мл этилацетата оставляют стоять в течение часа при комнатной температуре и затем разбавляется с 20 мл этилацетата. Смесь встряхиваю: сначала с 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты, затем с

10 мл 5Z-ного раствора бикарбоната натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и затем упаривают в вакууме. Остаток укрепляют с н-гексаном, отфильтровывают и промывают с н — гек—!

277903 саном. Получаемый защищенный дипептиц (выход: 8 1, 27.; т. пл. 92-95 С;

R < = 0, 75) обрабатывают с 30 мл 4 н. солянокислого диоксана в течение

30 мин, затем упаривают до сухого ос- 5 татка. Свободный дипептид (R = О, 10)

2 растворяют в 10 мл диметилформамида, раствор нейтрализуют с 0,35 мл триэтиламина и полученную суспензию добавляют к приготовленному следующим образом смешанному ангидриду: 10,6 г (3,0 ммоль) Z-Arg(NO, )-ОН и 0,42 мл (3,0 ммоль) триэтиламина растворяют в 5 мл диметилформамид. Раствор охлаждают до †!О С и при этой темпера 1 !5 туре смешивают с 0,36 мл (3,0 ммоль) пивалоилхлорида капельным образом. К полученному таким путем раствору смешанного ангидрида через 5 мин при

-I0 С добавляют раствор свободного пептида. Реакционную смесь перемешивают еще в течение 30 мин при О С, затем оставляют стоять на ночь и на следующий день испаряют до сухого остатка. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа и раствор встряхивают с

I0 мл 1 н. раствора соляной кислоты, затем с 10 мл 57-ного раствора бикарбоната натрия и, наконец, с !О мл воды. После сушки органическая фаза

30 упаривается до сухого остатка и полученный остаток укрепляют приготовленной в соотношении 1:1 смесью эфира и и-гексана. Получают 1,82 г (выход 847) защищенного трипептида с

R! = 0,70.

Пример 3 (метод С). Z-Arg (NO>)-Lys(Z)-Asu-Ual-OÍ (III).

2,51 г (12 ммоль) Val — OtBu HC1 растворяют в 50 мл хлороформа. Раствор смешивают с 3,86 r (10 ммоль)

Вос-Asp(OtBu) — OSu и 1,68 мл (12 ммоль) триэтипамина. На следующий день раствор встряхивают сначала с 3"10 мл

1 н. раствора соляной кислоты, затем с 3 10 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия. После осушки растворитель отгоняют. Полученный в качестве остатка защищенный дипептид (R = 0,80) растворяется в 30 мл 5 н.

2 уксусной кислоты, содержащей бромистый водород, и раствор оставляют сто— ять на неделю. Затем реакционную смесь упаривают до сухого остатка и остаток укрепляют безводным эфиром.

Получаются 2, 65 г (98, 27) Asu-Va I-ОН.

Hbr (R = О, 15) и ацилируют дальше описанным в примере 1 методом. Данные защищенного тетрапептида содержатся в табл. 5.

Пример 4. Arg-Lys — Asp-VaI

АсОН (IU).

2,25 г (2,22 ммоль) Z-Arg(NO )

Lys(Z)-Asp(OBzI) — VaI — ÎNB (пример 1) суспендируют в 50 мл 90%-ной уксусной кислоты. Суспензия смешивается с

1 г 57. †но палладия на активном угле и через смесь в течение 14 ч пропускают водород. Затем катализатор отфильтровывают, промывают с 2<10 мл

907-ной уксусной киспоты, фильтрат объединяют с промывной жидкостью и затем упаривают до сухого остатка.

Остаток с водой и этанолом вновь упаривают, затем растворяют в 2 мл воды и смешивают с 30 мл этанола. Полученную суспензию фильтруют и осадок промывают этанолом. Получают

0,92 г (807) IV .сlcLl = -24,8 (С1;

10% AcOH); R = 0,10.

Аминокислотный анализ: Lys 1,05 (1); Arg 0,95 (1); Asp 1,04 (I); Val

0,95 (1).

Пример 5. Glp-Arg-Lys †AspVal АсОН (V).

4,1 г IBoc — Lys(Z) — Asp(ÎBzI)-ValONB растворяют в 10 мл 8 н. НС1 соляной кислоты в диоксане, через

15 мин добавляют 100 мл безводного эфира, выпавший осадок отфильтровывают, дважды промывают эфиром и растворяют в 20 мл ДИФА. К полученному раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0, а затем 3,5 г Вос-Arg(NO )P0fp и 0,98 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают I ч, упаривают, остаток растирают с

50 мл этанола, отфильтровывают, промывают этанолом (2 ° 10 мл). Полученный защищенный тетрапептид (R q = — 0,80) растворяют в 25 ип 8 н. НС1 в диоксане, через 15 мин добавляют к раствору 70 мл безводного эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают дважды эфиром и растворяют в

30 мл ДМФА. К раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0. а затем 2,4 г

Glp-OPfp. Реакционную смесь перемешивают 1 ч, добавляют 100 мл этанола, выпавший продукт отфильтровывают, промывают этанолом (2 " 20 мл). В итоге получают 3,9 г Z-Glp-Arg(NO )-Lys (Z)-Asp(OBzl)-Val-ONB с т.пл . 166172 С, R = 0,80.

2,2 r Z-Glp — Arg(NO )-Lys(Z)-Asp (OBzl)-Val-ONB суспендируют в 50 мл!

277903 качестве сравнительного эксперимента смешивают 200 мкп суспензии клеток и 400 мкл HHSS.

Полученные смеси инкубируют в воз25 духе, содержащем 5% двуокиси углерода, при 37 С в течение 1 ч, после чего смешивают с 200 мкл сусиензии 1%

SRBC и центрифугируют при 90g в течение 5 мин. 400 мкл веохней фракции (жидкости) удаляют и после осторожного повторного суспендирования берут для расчета образования Е-розеток по меньшей мере 400 клеток (образова ние розетки — когда 3 или более SRBC

35 окружают oдин лимфоцит). Статистический анализ осуществляется с исполь, зованием распределения Стьюдента.

Вследствие различной активности в отношении образсваний Е-розеток у лимфоцитон,, полученных от различных доноров и разли:ной их ингибируемости азатиоирином, вешества характеризуются их. способностью восстанавливать активность лимфоцитов к образованию Е-розеток, ингибируемую азатиоприном, выраженной в % воссòàíîâëåíèÿ (R i): ле этого стеклышки ставили на моди— 15 фицированную встряхивающую машину для борьбы с желчнокаменнои болезнью и встряхивали в течение 30 с

1 (частота встряхивания: 65 мин, высота подъема 8 см). С целью фиксирования розеток к каждсй трубочке добавляли 50 мл 0,1%-ного глутарового апьдегида. Через 3 мин под микроскопом насчитывались более чем три лимфоцита, связывающие происходящие от овцы эритроциты, всего оценивались

4 100 клеток. Сепарированные лимфоциты содержали в качестве загрязне-ния макрофаги и иолиморфноядерные

90%-нс и укг усной кислоты, добавляют

1 г 5%-ного Рс1/С и н течение 14 ч гидрируют. Затем катализатор отфильтровывают, промывают !О мл 90%-ной уксусной кислоты, объединенный фильтрат упаривают, остаток растирают с

30 мл этанола, образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этанолом (2 х 10 мл) и сушат.

В итоге получают 1,12 г (93%) V.

Полученный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле SI-100 с использованием в качестве элюента системы: метанол вода 1: 1. В итоге получают О, 74 г V

cf8) = -51,3 (C 0 9;. 10%ная уксусная кислота).

Аналогично получают ряд других пептидов, физико-химические характеристики которых приведены в табл.

1 — 2.

Иммуномодулирующая активность описываемых соединений была изучена B опьп ах in vitro u in vivo по известным методикам.

1. in vitro °

Изучение на активные E-розетки проводилось с помощью модифицированного способа Wybran и др. с .пимфоцитами частично здоровых, частично аустоиммунно больных людей (ревматоидный артрит и системная вопчанка красная). К 50 мл клеточной суспенэии лимфоцитов, смотря по обстоятельствам, добавляют 100 мл разбавленного до концентрации от 10 до

10 мол/л изучаемого вещества. Смесь о инкубировали при 37 С на воздухе„ содержащем 5% СО в течение 60 мин и затем смешивали с 50 мл 1%-ной суспензии эритроцитов (овечьих) . Затем в течение 10 мин центрифугирова-1 ли с числом оборотов 1000 мин . Посклетки (максима:>с,ио !0%). ч1асто вязывающие po .tåòêè клетки корригиро— вались в каждом случае до этогo значения. Полученные результаты представлены в табл, 3 — 4.

Тест ингибиронания азатиоприном

Е-розе гок.

Сусиензию клеток, содержащую

2 10 лимфоцитон/мл, получают из крови здоровых доноров, выбранных ио случайному закону. Тест на ингибирование азатиоирином Е-розеток выполняется согласно ранее описанному способу. Коротко, этот способ состоит во введении в 200 мкл суспензии клеток 500 мкл азатиоприна и 200 мкл

HBSS без добавок, или содержащего исследуемое веше.тво. Вещества подвергают испытанию при концентрациях в пределах от 1С до 10 моль/л. В

100 (Э кои-LRFC-А-ЕКГС)

ERFC — Az — ERFC где ЕИ С H Az-Е1СЕС обозначают средний процент клеток, образующих Š— розетки, без ингибитора и в присутст— вии азатиоприна соответственно.

Эксп-ЕRFC представляет собой процент кле ток, об раз ующн х F,-роз ет ки, в присутствии азатttottpHHJ H экси«риментального вещ ства.

Полученные ре зультаты пред<.:танлены в табл. 5.

II in vivo

1. Для изучения оказывающего влияния на продукции антител действия 5 выбирали метод Цегловского.

Новорожденным WiStar — крысам самое позднее в 12-й час после их рождения внутрибрюшинно вводилось подлежащее изучению вещество в форме

25 мл жидкости с концентрацией от

3 -7

4 10 до 4 10 мол/л (единичная доза на каждые 9 животных). В возрасте

14 дней животные иммунизировались путем внутрибрюшинного введения каждому 0,5 мл 57.-ной суспензии эритроцитов овцы, и на 7-й день после иммунизации животные обескровливают путем декапитации. Кровь каждых трех животных объединяют, в течение 10 мин центрифугируют с числом оборотов

3000 мин и в таким образом полученной сыворотке определяют титр антител по методу Така tsy.

Результаты выражались как титр агглютинации, причем в качестве титра принималось то наибольшее разбавление сыворотки, при котором еще различимой является агглютинация. Результаты сведены в табл. 6.

2. Число клеток, производящих специфические антивещества, определялось по методу Ganningham.

Суть метода состоит в том, что из 35 клеток селезенки иммунизированных животных, из суспензии эритроцитов овцы и комплемента готовится гомогенная суспензия и вводится в камеру пригодную для развития моноклеточных слоев. 40

Вокруг клеток, производящих антивещества, образуется постепенный ореол и число этих ореолов (пятен) идентично с числом клеток, нроизнодян1нх цифичное антивещество (Рlaguo (orming cells. Pl Ñ) .

Подопытные жинотны< мак<..нмум и»

12-й час после своего рождения один раз внутрибрюшинно обрабатывались с подлежащим изучению веществом. Согласно методу 1) каждое вещество изучалось в трех дозах. На 7-й день после иммунизации изучалась способ-. ность пропарированных из животных селезеночных клеток к образованию

Plague.

В табл. 7 указано частное от числа Plagues обработанных животных и числа Plagues необработанных контрольных животных.

Как видно из данных, приведенных в табл. 3 — 7, соединения, получаемые предлагаемым способом, обладают широким спектром иммуномодулирующего действия в сочетании с низкой токсичностью, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения пептидов общей формулы

Х-Ag- у -V где Х вЂ” водород, Glp;

V-Asp, Asp-Val, Азр-Ча1-NH, AspVal-0Ие, Asn-Val, Asp-Ala, Asp-Ile„

Ala-Val, Glu-Val, Asu — Val, в виде кислотно-аддитивных солей, о т л и ч а ю шийся тем, что синтез осуществляют путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с эфира С-концевой аминокислоты, методом активированных эфиров и методом смешанных ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитных групп каталитическим гидрогенолизом. (ч х

О

"ч

rJ л

1 х

CL п}

} а, (о

Р4

О

»

О

Х

О

g о) (О (- ьс (О

t о

Ц

О х

Х х (d

1 (, О и (О

05 (о е х о

i 1 л и о х мч о о} м о

0l

1 а о а.9 м с 1 г о ( л о

C(M о о о и о л и о

CO л

C) о

f о

С!

Р о ((q

-.т л о л .О о л

-4 л о со л о

00 л о

Г«« л о о о (d х .9 а о ч.о с!

1 (1

CO

Р !

Ч(.4 м О с4

1 с4

CO

1 о м

Р4 (I .О чЮ

-4 и

1 о о

Г й! ь1

Р \

t (Г( с«1 с

Ch

I м

Оч (Р4

1 (4

C( с4

Ch

О ч с 4 1

} !

1

1

I 1

1 Ч-1

0 4

О

»

О ((}

Х

» o

1" х (о х х

1 а х (а х а .9 (о

C, о х (d

1 (ч1 х

"d х

О

»

О

Х

» х о} х

1 о«о о а

9 о (О I

Ц о о (х х сч) 1 ((1

Q Я х

О

dt

М о

О (4 ((1

1.» (tI 1

1 1 (d!

С4 1

4Ч и

cCt о ((«, С4 л

Ш

З о

I (! (ф

<

1 (О

»

1 дч

C)

-4

С(}

«

1 х

И .0

I ч с 1 г (л

» л1

1 л-4 о л ч

14

I

:«3 о Я

ОО

}4

-х

1 :4

С(ч

1 tf I о»х о 1-хх

Х I P t»

& 1

И (dt! 1

И I Ф

1 ,а 1 !" Х х u x х

Ф

1 М ((! 1

1 рд ((( (0

E» I

О I

1 о ((\ I

О х

dJ 1

Х 1

Х I (0 !

t

1

1(» (!! 4

1 Ф к о

«-4 ((! Р

I Л ! a !

I а

I (О

1

» ь4

-

I с4 о

?4 . г

}4

1 (! л

Ф о

1 — 1

М о а (О

I а

>Ъ

«Л

1 с4 о

Х

1

r-4 (о l л (4 с0 о а

1 ъ м4

I ч с

ЬО

Е о

1 ((}

-4 (4 с( о

Я 0

» м!

Э

К

b0

14

t (4

11

?« о

1 -4 х л

4

N с(-( о а (C

«Х

М гл

»

i э

"44 сЛ (ч0

14

I а

С3 ! (4 л

1 (- C1 с

1 с-4

Ж о а х

I л

»

Л

I с о о0 !.

1

Q,.. о

M л

N с( о

1 ( (О

Й

1 (л

» ч л

\ 4 (ч)

00 4 х

1 («3

Д

К о

1 (о (i

N (0

0 а

Сч}

«ч

I о

Х

С0 !

4 х

I (1

«4

Ы о

1 о}

4 (-4

1 л (4

CCt о а л

«

1 (4 (л

»

1 о

?; г (40

}4

«О

t (4

4 (о

t

0С} о а л

I

Сч!

»

1 (4 о

Wj

О (4

4 Ч

I а

«-4

С3

I ч о

4 (6 1

1 г-4

Г !

t л

N I (Cl о

1 (!

1 1!

1! (л I

1 i

1 1

1 с(1

00

«!

I м !

1277903

Таблиц&2

Свойства свободных пептидов

22 Ф 1Р ) Вь!ход, 7. кс

Пептид

0,10 (8) -24,8

0,20 (7) 0

0,20 (7) -26,5

84,3

84,6 0,35 (5) -28,3

5 Glp-Arg-Lys-Asp-Val

-51,3

Ф е

6 Glp-Arg-Lys-Asp-AcOH

-31,4

79,5

-23,0

88,5

-34,6

-31,0

88 — 19,0

48,6

-19,5

-51,5

-21,4

80,0

" с =1, в 10Х-ной уксусной кислоте. хроматографированный в колонке, эаполненной силикагелем Sl-100 водой и метанолом 1:1.

AcOH = уксусная кислота.

Таблица 3

Связывающая Е"роветки активность лимфоцнтов, страдающих рематондным артритом (выравенная в процентах активности лнмфоцитов, и 4) нцентрация (написанная как отрицательный десятичный логарифм нцентрацин, мол/л) Лептид

II . 9 7 5 3 ЙХ

6,3

26,7

7,4

36,2

3l,5

34,4

29,4 32,6 36,8

26,4 28 ° 4 30,7

26,4 28,2 34, 8

20,8 26,6 25,7

26,4 26,5 27,9

23,7 20,4 19,4

2 Arg-Lys-Aap-Val ,3 Arg-Lys-hsp

4 Arg-!.ys-Asp-Vel — NH

5 !.ós-Аг&-As@-Val

6 Arg-!.уа-Asp-Va1-Оне

С 1р — Ar g-!.уг -Asр — Va 1

4,3

27,2

2&,6

28,8

29,8

2,4

3!,5

26,8

23,6

25,8

21,2

6,0

31,2

30,6

32,4

-4,3

22,8

23,2

21,4

1 Arg-l.ys-Asp-Val AcOH

2 Arg.-Lys — Asp-AcOH

3 Arg-Lys-Asp-Val-NH 2АсОН Z ..

4 Arg-Lys-Asp-Val-OÌå 2АсОН

7 Arg-Lys-Asn-Val AcOH

8 Arg-Lys-Ala-Ча1 ЗАСОН

9 Arg-Lys-Asu-Val 2АсОН

10 Arg-Lys Asp-Ala-AcOH

11 Arg-Lys-Asp-Ile-AcOH

12 Glp-Arg-Ly Asp-Val-Tyr

13 Arg-Lys — Glu — Val AcOH

I Arg-Lys-Азр-Чаl-Tyr (TP5) 23,6 26.7 26,8 29,9

0,40 (5)

0,35 <5)

0,10 (5)

0,45 (5)

0,15 (5)

0,25 (5)

0,15 (5)

0,20 (8)

0,30 (7) г?? ОЗ!

Про!!ол!кенне табл.З нцентрвция (написанная как нцентрации, нол/л) отрицательный десятичный логарифм

Пептнд г !1 1 9

8 G! p-Ar g- Ly s-Ав р б б

9 Arg-Lys-hsn-Vsl

10 Arg-Ьув-Авп-Val

i9,$

18,,7

20,6

-5,3

24,?

21,9

22,3

24,3

22.,5

23,6

7,8

11 Arg-Ala-Asp-Val!

9,8

20,2

21,8

23„4

l2 Arg-Lys-h1a-Val !

3 Ala-Lys-Авр-Чаl

14 Arg-Lys-Авр-Аlа

l5 Лт8-Lys-Asp-Ila

l6 Arg-Aep-Lys-Val

2l,7

20,3

4,7

22,5

22„8

25,3

25,8

24,5

28,6.+2,2; -1,1

-4,5; +1:О

23,2

25,4

25,5

26Ä2

26,4

25,4

17 Glp-Arg-Lys-hsp-Val-Tyr

22„7

22,6

24,1

5, II бб

0,05 Г тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на TP5) 0,05 co Student-Test.

Таблица 4

Пептид. 29,4

1,6

24,4

23,,7

I Arg-Ьув-Аа р-Чаl-Tyr (TP5) 2 ?б 8 25,2 2?, I

9,2

41,3

38>5 39„1

33,8 33,7 43,0

l I,4

34„ I

29,9

30,3 35,9 39,3 41,7

7,8

33„8

30,3 :!8,! 26,6

35,3 40,5 36,4

35,1

29,0

4I,2

:39,„6

5,9

40,8

:34 „9

43,4

35„3 36,2

39,1

47,5

29,4

27.,2

26,8

23,8

-5,9

29,7

Фбб

8 hrg-Авр-Lys-Val

32, 1 36,4

30,3 38,!

40,4

37,,5

34,2

37,7

:33,, 8

9 Glp-АГ8-Ьув-Asp

10 Ат8-Ьув-Аlа-Ча l

+7,8, -3,7

26,6

29, I

35,1

34„7 0,9

-4

33,3!

0,5..Ач5

35,8

32,5

33,4

36,0

32,4

38,2

34,7! I Ахц-АЬа"hsp-Val !

2 Lys-Агр-Авр-Vsl !

Э krgLys-Asu-Ча1

3I,5

25,6

30,0

28,9 32,9

29,7 31,5

29,1

Z9,0

2,6

29,3

29„7

32,3 бб

33,2

4,3

32,9

39,,1

31,9 33,0

36,2

I0 Arg-Lys-Glu"Чаl б б

15 Лц-Lys"Авп-Val

35,5

7,0

35.,4

32,1 36,7

2 Arg-Lys Asp-Ча1

3 Лг8-Lys-Авр

0 Ат8-!.ув-Авр-Чаl-!!Н в

5 Атg-Lys-hsp-Ala б Лlа-Lys-Asp""Val

7 Arg-Lys-Авр-Чаl-ОИе

23,7 18,4 !9,7

27,7 24,3 23,7

20,8 25,0 28,6

23,7 22,5 20,7

20,8 23,1 25,5

23,7 20,3 23,9

26,4 27,9 25,3

27,7 24,5 28,7

27,2 27,5 27,3

20,8 24,9 26,6

Свяэываюа!вя Е-розетки активность лимфоцитов здоровых в процентах г ахтивнссти лнмфоцитов, п * 4

Концентрация (написанная как отрицательный десятичный логарифм, вывахеиный в мол/л коыцентрации) ю(Г9 Т I 7 (! 277903

ПродОЭ)же)!!)Е тд()Л. 4

Пептид

> б

l6 hrg-Lys-Asp-Пе

l7 С1р-Arg-Lys-Азр-Val-Tyr

-2,5; +2,Э

+5,8

ЭЭ2 307 35,0 349 320

24,) 29,9 25,5 29,4 22,5

35,5

29,9

Ф Ф

Р 0,05 г Р тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на TP5);

++>

Р 0,01 F тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на TP5); P 0,05 Student значительное действие.

Таблица.5

Эффект аналогов, TP-5 н левамнзола s отноаенин ннгибируемого азатнопрннон образования Е-розеток сстановление в О, в присутствии соединения концентрации, мол/л

Соединение

I0 10 10з

47,653,3

30,055,5

4l,0+8,!

50> 2.- 3> Э 31 ° 814>О 26 ° 714>6

45 9+3 0 .!4 ° 8-5 5

29,4+5,6

l6,2+1,8

3l ° 755>4 29,344,0 3),7+4,3

56,)+8,2

47,4+-4,3

32 566 1

46,457,0 35 445 ° 6 35,4+5,5

34,0+6,7

l2 ° 1 1,9

16,8+4,7

39,2+6,0

53,6>6 ° 3

64,6-3,7

54,4 4,7

39,9+4,3 $1,9з9,9 37,283>5

33 ° 9+6,9

17,4 3,6

24,1з3,8

15,9т3,6 23,9тЭ,& )4>3+4>1

l8,5>6,0 2& 8+5,7 11,5r) ° 8

13, 3+1, 3

16, 7+4, 7

17,9+6,4

Gl p-Ar g-Lys-As p-Va 1

17,9 3,8

23,3 6,0

37,9+7,6

l5,6+2,0

13 ° 0- 4,0

1&,915,3 28,5+6,1 12 ° 2 3,5

52>4+4 4 11>7лЭ 3

7I ° 8+1, & 23,0+4,5

Glp-Аг&-Ьув-Авр

Arg Lys-Asn-Va1

42,417 3

37,) 6,6

30, 156,6

27,556,5 18;1З7 ° 2

27,9+4,4 26,2+6,8

23,544 ° 1 22,7+4,8

)9,614,2

Arg Lys-Аlа-Val

54,6+1,6

46,0+1, 3

)9, l-),9

11,2+1,0

l 8, 1+6,2

Ar 8,-hays-Asu-Va1

40 957 9 38,4+5,8 ° 27 4ЗЗ,О.

30, 0>4, 9 25, & 10,4 22 ° 1 6,2

26>8>5 ° 5

13,9 З,Э.

57,0+3,7 2),6+7,5

13, 7+2 ° 4

I9 ° 1-1 Я

19,7 Э,6

56,6+3, Э

54,6 -1,6

58, 7 6,6!

7 ° 422 ° 4

22,5+-4,! 21 ° )>3,3 I ),853,0

17,9 $,6 22 ° З>5,8 23,8+7 ° 2

30,0 5,)

18,448 ° 6

29,92$,3

)$,&=3,6 )0,2з4,8 !2.884,0

56>653>3 13 ° 7r2 ° 4

40,)з7,8 12,3+6,0

64,4 5,0

27,051 ° 4

22,9+3,9

Таблица

Пе пт ид (TP5) l2iO-0

lO 5+I,5

9,0 1 7

9,3 1,5

В>7з2>Э 10.7-2.3

l Ar g-Ly s-Аз р- Ча l- Ty r

9> Э- 1,5

I1,5-0,9

12,0 --O

2 Arg-Lys-Asp-Ala

Э Атц-Ьув-Азр

7>Эт0>6, 5,2 -1,3

6,0 1,2

6, 0++0

Lsvamiso1e

Arg Lys-Asp-Va1-Tyr

Arg-Lys-Авр-Чаl

Ar g-Ly s-As p

Arg-Lyв-Asр-Va1-NII

br 8-Lys-Asp-Vs 1-0))е

Аг&-Ьув-Asu-Va1

Arg-Lys-Авр-Аlа

Arg Lys-Авр-ЬТе

Arg-Авр-Lys-Val

Glp-Àrg-Üóâ-Asp-Val-Туг

ArgLys-G1u-Ча1

Концентрация (написанная как отрицательнъгй десятичный логарифм, выраженньй в мол/л концентрации)

00 (11 ) > т 7 ) > 1 э L л>

21, 7+3,0

22,4+-6,0

3) ° 6+-4,3

21,7 3,0

9,5+3,1 1&,7"5,2

21,9 5,8

24,6+1,4

Действие in vivo, выполняющее продукцию антител, выраженное как титр агглютинации (титр антител А >- SD) Концентрация, мол/л .Х 1. I Х I (4"10 4 10в 4 10 4 )0 4 IO 4 10в 0

127?903

Продолжение табл.6

Концентрация, мол/л

Иептид

4 f0 4 4 0

6,8 0,8 5,2+1,3

5,2 -2,2

4 hrg-Lys-Лер-Val-NH

+Ф

5 Glp-Arg-Ьуа-Аар-Val-Tyr

6 Ир-hrg-Ьуе-Asp-Ча1

7 Arg-Ьув-Лар-Val-OMe

6,2 -2,0

5,5+0,6

5,2 -0,8

5,2-l,3

&,3 0,6

9,0+2;6

6,0 I,7

7,2tf 3

5,5 2,6

9,3 1,5

5,2- 1>3

4,5 -0,5

P 0,05 с Student тестом;

" концентрация изучаемого аещества составляла полонину укаэанного ssepxy значения;

"концентрация 2. l0 "мол/л.

Таблица 7

Действие, выполняющее р1а8ие-связывающее селезеночные клетки

Концентрация, ммоль

PFC-число (обработанное) Пептид

PFC-число (контрольное) 1i0 l0

1,0 10

1,0 10

1,0 10

1,0 l0

l,0 l0

2,5 10

2,5 10

1,0 10

1,0 10

1,0 10

Arg-Lys-Asð

0,7

2,1

1,8

Ar g-Ly s-As р-Va1-NH, 0,3

0,52

2,7

Arg-Lys-Азр-Val

0,34

0,8

Arg-Lys-Asp-А1а

4,9

1,9

3,0

Составитель О. Галкин

Редактор В. Ковтун Техред И.Попович Корректор А. Тяско

Эаказ 6766/60 Тираж 343 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий!

13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород„ ул. Проектная,g