Питательная среда для выделения и отбора микроорганизмов- продуцентов протеазы

 

Изобретение относится к области микробиологии и касается состава питательных сред для вьщеления, отбора и селекции микроорганизмов - продуцентов протеазы. Целью изобретения является повьшение степени точности вьщеления и отбора активных штаммов - продуцентов протеазы. Сущность изобретения заключается в том, что для отбора активных продуцентов протеазы используется агаризованная гштательная среда, содержащая .бромкрезолпурпур, казеин технический, ;lienToH, глюкозу , дрожжевой экстракт и минеральные соли при следующем соотношении компонентов, г/дм воды: агар-агар 35,0-40,0; казеин технический 4,0- 6,0; пептон 5,0-7,0; глюкоза 1,0-2,0; хлористый кальций 0,003-0,005; серно- g кислый магний 0,005-0,007; бромкрезолпурпур 0,016-0,018. Отбор активных продуцентов протеазы на предложенной среде производят по величине зон гидролиза казеина вокруг колоний, которые выглядят прозрачными на светло-фиолетовом фоне. 2 табл. (/)

СООЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) (59 4 С 12 N 1/20 9/48//

//С 12 N 1/12, С 12 R 1:07

С 2 20 С 12R 66

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ д

И АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1

ВСГ» ), );Р»1Р (21) 3715864/28-13 (22) 27.03,84 (46) 30. 12.86. Бюл. Н 48 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) Т.Ю.Падегимас, И,Л.Иармене, А.Л.Юргулис и M.Â.Ïåòêåâè÷þòå (53) 663. 11(088.8) (56) Klinbergerg P. et оl, 19?9, Gavinnung, und charak terisierung

von proteasen aus Thermoactinomyces чи1яагхз Leitschrift fur allqemeine

Mikrobiologie, v. 19 . р. 17-25...

Биосинтез микроорганизмами нукле" аз и протеаз ° M. Наука, 1979, с. 205-216. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ

И ОТБОРА МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

ПРОТЕАЗЫ (57) Изобретение относится к области микробиологии и касается состава питательных сред для выделения, отбора и селекции микроорганизмов — продуцентов протеазы. Целью изобретения является повышение степени точности выделения и отбора активных штаммовпродуцентов протеазы. Сущность изобретения заключается в том, что для отбора активных продуцентов протеаэы используется агаризованная питательная среда, содержащая,бромкреэолпурпур, казеин технический,,пелтон, глюВ козу, дрожжевой экстракт и минеральные соли при следующем соотношении компонентов, г/дм воды: агар-агар

35,0-40,0; казеин технический 4,06,0; пептон 5,0-7,0; глюкоза 1,0-2,0; хлористый кальций 0,003-0,005 сернокислый магний 0,005-0,007; бромкрезолпурпур 0,016-0,018. Отбор активных продуцентов протеазы на предложенной среде производят по величине зон гидролиза казеина вокруг колоний, которые выглядят прозрачными на светло-фиолетовом фоне. 2 табл. I 12800

Изобретение относится к микробиологии и касается состава питательных сред для выделения отбора и селекции ликроорганизмов — продуцентов протеазы.

Цель изобретения — повышение степени точности выделения и отбора активных штаммов-продуцентов протеазы.

Сущность изобретения заключается в том, что для отбора активных продуцентов протеазы используется агаризо- 1О ванная питательная среда, содержащая бромкрезолпурпур, казеин технический, пептон, дрожжевой экстракт и минеральные соли, на которой о выделении акт тивных продуцентов протеазы судят по величине зон гидролиза казеина вокруг колоний„ которые выглядят прозрачными на светло-фиолетовом фоне.

Пример 1. Приготовление пита.тельной среды. Отбор и выделение про- 2 дуцентов проводят на плотной питательной среде следующего состава, г/дм воды:

Агар †аг 35 0

Казеин технический 4,0

Пептон 5,0

Глюкоза 1,0

Дрожжевой гидролиэат 1,0

Хлористый кальций 0,003

Сернокислый магний 0„005

Бромкрезолпурпур 0,01б

Размешивают 35 г порошка сухого питательного агара, выпускаемого Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред, в 400 см 35 воды и кипятят 2 мин при интенсивном перемешивании до полного растворения.

Нагревают 400 см воды до 85 С, подщелачивают,цо рН 8,5 и прибавляют

4 г сухого технического каэеина, всы- 40 пая постепенно при непрерывном перемешивании. После прибавления казеина снова устанавливают прежнюю реакцию.

Раэмешивание производится постоянно, а подщелачивание несколько раз через каждые 15 мин до полного растворения .казеина.

05 2 со средой помещают в терчостат при

37 С на 24 ч.

П р и и е р 2. При подборе компоHeHòîâ питательной среды проведена экспериментальная работа, результаты которой представ.чены в табл. 1.

В таблице подчеркнуты оптимальные дозы компонентов, которые дают положительный эффект. Малые дозы компонентов или увели енные концентрации сверх оптимального уровня не стимулируют гидролиза штаммами-продуцентами протеазы.

Пример 3, Выделение и отбор продуцентов протеазы. Стерильные чашки Петри засевают приготовленным материалом из различных природных объектов. Помещают )3 термостат при 37 С на 36 ч. Микроорганизмы, продуцирующие протеазу, оце нивают по величине зон гидролиза казеина культуры вокруг

t колонии. Зоны гидролиэа казеина четко выражены, прозрачны на светлофиолетовом фоне.

Питательную среду можно использовать для ведения контроля инфильности во время биосинтеза протеазы и Ыамилазы в ферментерах.

Пример 4. Преимущества предлагаемого изобретения и его эффект . для отбора активн:лх продуцентов протеазы приведены в табл. 2.

Как видно, на предлагаемой среде протеолитическая активность в 2-5 раэ выше„ чем на изве .тной.

Установлена прямая зависимость между соотношением величины колонии продуцента и эоны гидролиза казеина, а также протеолитической активнос-тью.

Преимуществом предлагаемой питательной среды является более точный отбор активных продуцентов протеаэы за счет содержания в ней главным образом казеина технического и бромкреэолпурпура, позволяющих по глубоким зонам гтдролиза казеика определить наиболее активные яроиуценты

K 100 см подогретой до 85 С воды добавляют остальные компоненты и перемешивают до полного их растворения.

После этого все компоненты перемеши,вают, коррелируют рН до 7,4, доводят водой до 1000 м и автоклавируют при

123 С в течение 30 мин. Далее среду охлаждают до 50, С и разливают по стерильным чашкам Петри (по 10-12 мп) и для проверки на стерильность чашки протеазы.

Формула иэзбретения

Питательная среда для выделения и отбора микроорга низмов-продуцентов протеазы, содержащая источники углерода, азота, источник казеина, минерапьные соли, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения степени точности

Агар-агар

Казеин технический

Пептон

35 0-40,0

4,0-6,0

5 0-7,0

Глюкоза

Дрожжевой гидролизат

Хлористый кальций

1, 0-2,0

1,0-2,0

0,003-0,005

0,005-0,007

0,016-0,018 блица 1

Сернокислый магний

Бромкрезолпурпур

Т а

Компоненты

Содержание компонентов в г/дм воды

25,0 30,0 35 0 37 О 40 О 45,0 50,0

Агар

Казеин технический

40 50 60 65

3,0

3,5

7,0

4,5

3,5

5 0 6 О 7 О 7,5

Пептон

8,0

0,5

Глюкоза

2,5

3,0

0,75

Дрожжевой гидролизат

1 5 2 О 2,5

075 10

0,5

3,0

0,001 0,002 0 003 О 004 О

Хлористый кальций

005 0,006 0,007

0,002 0,004 О 005 О 006 О

007 0,008 0,009

Сернокислый магний

0,014 0,015 0 016 О 017 О 018 0,019 0,020

Бромкрезолпурпур

Таблица2

Микpooprанизмы

Известная среда

Предлагаемая среда

Размер колоПротеоли тическая

Размер зоны

Протеолитическая активность, ед/мп

Разме PasMe коло зоны нии, мм гидро- активнии, мм гидро лиза ность, ед/мл лиза казеина, мг казеина, мг

Ф

Вас. subtilis

1,5

1,О 3,4

1,0 3,7

3,0

Вас.subtilis p

Вас subtil is Р-623

Вас. зиЪ 1 - з ВИ-355

1,3

2,8

1,4

4,0

1,0

3,0

4,2

1,4

1,0

3,0

717

Вас. subtilis

Вас. subtilis

Вас. зиЬ д1дз

1,6

4,0

3,0

1,0

3,6

3,2

1,0 l,4

E

3,8

4,2

1,2

103 I,0

3 1280005 выделения и отбора активных штаммов— продуцентов протеазы, среда дополнительно содержит бромкрезолпурпур, пептон, глюкозу,, дрожжевой гидролизат в качестве источника углерода и азота, а в качестве источника казеина — казеин технический, из минеральных солей — хлористый кальций и сернокислый магний при следующем соотношении компонентов, г/дмз воды: 10

2,0 6,6

2,0 6,0

2,0 6,8

3,0 9,0

2,0 8,6

3,0 14,8

4,0 18,2

12800ni

Продолжение табл. 2

Предлагаемая среда

Размер зоны

Протеоли тическая

Размер зоны

Пр о те олити ческая гидрох(иза активHocTb ед/ мл ность, ед/мл

4,0 16,8

i,0

9,0

2,0

3,5

1.,3.,7

16,0

» 0

12,8

3,0

3,8

1(4,2

4,0

2,0 10,6

4,7 I.0

Вас. subtiiis

18,8

Вас „я Ь 1) я,о8

7,7

2,0

9 0 (, 7

2,0 I „8

3.„6

12,3

3. (3

2,,0

",.2

2, l„l

2,0., 0

7,6

2.0

2„0

1«0

6,9

2,0

2,,0

3,0

34 ;.

8,1

3,6

1.0

4,7

>.,7

? Г) 4«0

orvzae

oryzae

4,7

2 0

6,6

3,,6

6„6

1l,4

Аяр. oryzae

4,2

2,0

?,8 (, 0 -(, 7

Ьяр. oryzae

6,,8

3,7

16 —,,6

Asp ° awamor

6„7

2,0

25 4,3

Asp. awamori (.,0 2,0

6,6

- -, 0

Аяp ° анап(о п

Микроорганизмы

*. «1.

Вас. subti>is KP-349

Вас, subtilis 435

Вас. subtilis G-43

Bac «subti.Еis Ч 50

Вас. я (Ь ).1-(.я )4-7(Âàñ. ЯиЬ(-111.Я 163

Вас. mesentericus

Вас„ meseztericus 15()l-55

Вас „гпеяе1п ег с11я

Вас „mesenter icus

Вас. п(еяе ster icus

Вас. megateriun; 400

Вас. megaterium

Bac. megaterium

Ляр.

Asp. лиза

1\ О Л «5 и "» на мг

Е азмер колонииу

2,0 6,3

l„0 4,2

1,0 4,0

1280005

Продолжение табл 2

Микроорганизмы

Известная среда

Предлагаемая среда

Размер колоРазмер зоны

Протеоли тическая

PasMe Разме коло- зоны

Протеолитическая нии, мм гидро- активнии, мм гидро лиза активность ед/мл ность, ед/мп казеина, мг

2 4,2

1,0

6,2

2,2

4,2

1,0

3 4,0

6,4

1,0

2,0

1,0

5,0

6,0

2,3

1,0

4,7

1,0

Asp.awamori

6 1

2,9

1,0

6,8

2,0

Asp.awamori

6,0

1,0

3,2

2,0

Составитель В. Соина

Редактор Т.Митейко Техред П.Олейник Корректор М.Самборская

Заказ 7020/23 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Asp. awamori

Asр. awamori

Aspic awamori

4 4,2

5 4,0

6 3,4 лиза казеина, мг