Способ получения агглютинирующей эшерихиозной анти-к88 сыворотки

 

(19)SU(11)1277459(13)A1(51)  МПК ⁶    _{A61K39/40, C12N15/00C12N15/00, C12R1:19}(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ ЭШЕРИХИОЗНОЙ АНТИ-К88 СЫВОРОТКИ

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано при получении агглютинирующих сывороток для диагностики колибактериоза поросят, а также для контроля К88 антигена у производственных штаммов эшерихий и его содержания в вакционных препаратах, применяемых для профилактики колибактериоза животных. Целью изобретения является упрощение способа получения сыворотки путем исключения процесса иммуноадсорбции, а также повышение ее активности и специфичности. Достаточно высокий диагностический уровень К88 антител у кроликов достигается внутривенным введением с интервалом в 6-7 дней живых клеток штамма РМ-1 (К88) в следующих оптимально выбранных дозах: первая инъекция 2 ± 0,5 вторая 4 ± 0,5, третья 8 ± 0,5 и четвертая 12 ± 0,5 млрд микробных клеток. Кровь для получения сыворотки берут через 7-8 дней после последней инъекции антигена. Штамм Е. Сoli РМ-1 (К88) получен с помощью конъюгации 50-мегадальтонной плазмиды К88, детерминирующей синтез одноименного антигена, от полевого штамма Е. coli РД-21 (0149:К88ас:Н^-), выделенного от больного колибактериозом поросенка, на штамм E.coli С600 thr^-, len^-, B^-, Lac^-, и последующей селекцией стабильного моноплазмидного трансконъюганта Е.соli РМ-1 (К88). Штамм Е. соli РМ-1 (К88) депонирован в коллекции микроорганизмов Всесоюзного Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов МСХ СССР, регистрационный номер 382-37/14. Штамм Esherichia coli ВГHКИ N 382-37/14 характеризуется следующими свойствами. Морфологические признаки. Микробные клетки представляют собой грамотрицательные неподвижные палочки длиной 1-3, толщиной 0,6-0,7 мкм, капсулы не образуют. Культуральные свойства. Штамм ауксотрофный, не растет на минимальной среде без добавления треонина, лейцина и витамина В₁, хорошо растет на мясопептонном агаре (МПА), полужидком мясопептонном агаре и мясопептонном бульоне (МПБ). Через 15-18 ч роста на чашках с МПа вырастают круглые, слегка выпуклые, серо-белые, полупрозрачные, средней величины 2-4 мм колонии с изрезанными краями. Колонии хорошо снимаются бактериологической петлей и легко смываются изотоническим раствором хлорида натрия. В МПБ через 4-6 ч роста штамм вызывает слабое равномерное помутнение среды, через 15-18 ч образуется незначительный, легко разбивающийся осадок. Ферментативные свойства. Сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, рамнозу, ксилозу, сорбит и рафинозу, не сбраживает лактозу, сахарозу и дульцит, образует индол и не образует сероводород, дает положительную реакцию с метиловым красным, не образует ацетилметилкарбинол, желатин не разжижает, не продуцирует гемолизин и колицины. На среде Эндо вырастают бесцветные, прозрачные колонии. Штамм чувствителен к стрептомицину, тетрациклин, хлорамфениколу, неомицину, канамицину и налидиксовой кислоте, устойчив к 100 мкг пенициллина. Чувствителен к колицинам V, B, D, E + Y, F, 9, C, H, j + H, K, Sg, A. Вирулентные свойства. Штамм не вирулентен для белых мышей и кроликов при внутрибрюшинном введении микроба в дозах соответственно 5 и 10 млрд микробных клеток. Введение клеток E. coli ВГНКИ N 382-37/14 в организм кроликов не вызывает образования у них 0 и Н-антител. В сыворотке накапливаются в основном К88 антитела. Штамм находится в R-форме, имеет хорошо развитый поверхностный антиген К88 и не содержит ни один другой из известных для эшерихий 0, К и Н-антигенов. При кипячении в изотоническом растворе хлорида натрия микробная взвесь штамма выпадает в осадок в виде хлопьев. П р и м е р 1. Для получения диагностической агглютинирующей анти-К88 сыворотки штамм E.coli ВГНКИ N 382-37/14 выращивали в течение 24 ч при температуре 37^оС на мясопептонном агаре (рН 7,2-7,4), проверяли культуру на чистоту, смывали, физиологическим раствором и устанавливали концентрацию 2 млрд микробных тел в 1 мл. Полученную взвесь использовали в качестве антигена для иммунизации кроликов массой 3-3,5 кг. Антиген вводили внутривенно четырехкратно с промежутками между введениями 6-7 дней нарастающими дозами: первая инъекция 2, вторая 4, третья 8 и четвертая 12 млрд микробных клеток. Кровь для получения сыворотки брали на 7-10 день после последней инъекции. Консервировали сыворотку борной кислотой. Полученную сыворотку проверяли на активность в реакции агглютинации на стекле, в пробирочной реакции агглютинации и реакции диффузионной иммунопреципитации. Титр антител анти-К88 сыворотки в серологических реакциях с полевыми и эталонными штаммами эшерихии приведен в табл. 1. Результаты проверки специфичности сыворотки приведены в табл. 2. П р и м е р 2. Для получения агглютинирующей анти-К88 сыворотки штамм Е. coli ВГНКИ N 382-37/14 выращивали в течение 24 ч при 37^оС на мясопептонном агаре (рН 7,2-7,4), проверяли культуру на чистоту, смывали физиологическим раствором и устанавливали концентрацию 4 млрд микробных тел в 1 мл. Полученной взвесью иммунизировали кроликов массой 3-3,5 кг. Антиген вводили внутривенно четырехкратно с промежутками между введениями 6-7 дней нарастающими дозами: первая инъекция 2,5, вторая 4,5, третья 8,5 и четвертая 12,5 млрд микробных клеток. Кровь для получения сыворотки брали на 7-8 день после последней инъекции. Консервировали сыворотку борной кислотой. Полученную сыворотку проверяли на активность в реакции агглютинации (РА) на стекле, в пробирочной РА и в реакции диффузионной преципитации (РДП). Титр антител анти-К88 сыворотки в серологических реакциях с полевыми и эталонными штаммами эшерихий приведен в табл. 3. Результаты проверки специфичности анти-К88 сыворотки приведены в табл. 4. Как видно из результатов табл. 1-4, использование моноплазмидного штамма Е. соi РМ-1 (К88) в оптимальных иммунизирующих дозах позволяет получать достаточно активные и специфичные анти-К88 сыворотки,
Полученная сыворотка имеет титр К88 антител в реакции агглютинации на стекле 1:20-1:80, в пробирочной реакции агглютинации 1:400-1:1600 и в реакции диффузионной иммунопреципитации 1:32. Применяемая в реакции агглютинации на стекле в разведении 1: 10 сыворотка характеризуется высокой специфичностью, она не агглютинирует штаммы Е. coli, не имеющие К88 антигены, и во всех случаях в течение 5-10 с образует типичные крупнохлопчатые агглютинаты со штаммами кишечной палочки, обладающими антигенами К88. В предлагаемом способе в отличие от существующих методов получения агглютинирующей анти-К88 сыворотки для гипериммунизации животных-продуцентов используется живая культура моноплазмидного авирулентного штамма Е. coli ВГНКИ N 382-37/14. Штамм является носителем единственной плазмиды К88, ответственной за синтез одноименного антигена, он не имеет каких-либо известных для эшерихий 0 и Н-антигенов и авирулентен для лабораторных животных. Применение указанного штамма для иммунизации в живом виде исключает какую-либо инактивацию К88 антигена, которая неизбежно наблюдается при использовании убитой формалином или другими химическими реагентами культуры. Использование предлагаемого способа в ветеринарной практике позволяет усовершенствовать и упростить диагностику колибактериоза поросят, помочь расшифровать этиологическую структуру этой болезни, на основе чего повысить специфическую активность биопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения колибактериоза поросят.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ ЭШЕРИХИОЗНОЙ АНТИ-К88 СЫВОРОТКИ путем приготовления антигена из штамма Escherichia coli, иммунизации им кроликов-продуцентов, взятия крови с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения активности и специфичности сыворотки, в качестве штамма используют моноплазмидный штамм Escherichia coli ВГНКИ N 382-37/14, а иммунизацию продуцентов проводят четырехкратно с интервалом между инъекциями 6 7 дней в дозах, соответственно равных 1 2,5; 4 4,5; 8 8,5 и 12 12,5 млрд. клеток.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3