Способ определения амилолитической активности ферментов

 

Изобретение относится к области анализа активности ферментных препаратов и может быть использовано в микробиологической промьшшенности. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени определения активности . Сущность способа заключается в нахождении оптимальных концентраций фермент-субстратного комплекса , когда ферментативный гидролиз 6,1С-0,Т5%-ного раствора растворимого крахмала продолжается от 15 до 45 с. Смесь гидролизата и раствора йода фотометрируется при длине волны 625 нм и показателем светопропускания служит выходное напряжение фотоприемника , для чего применяется цифровой электронный вольтметр. Такой прием анализа позволяет определять величину активности в 1 мл раствора препарата от 20 до 400 ед, производя всего лишь одно из двух разведений: в 100 или 500 раз. По результатам выходного напряжения находится величина амилолитической активности по заранее построенному калибровочному графику. Способ прост в исполнении, а также и в его автоматизации, может быть использован в микробиологической промьшшенности и в любой другой, где занимаются анализом активности. «i-амилазы. Применение способа увеличивает точность определения и сокращает время анализа. 2 табл. § (Л to со 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

pm

\ Ю

h4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3828757/28-13 (22) 20.12.84 (46) 28.02.87. Бюл. 9 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (72) П.Н.Евтихов, Л.З.Касицкий, О.Б.Комаров, Л.В.Курзина, Г.К.Медведева, В.В.Митяев и А.П.Пушкина (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР .

В 449934, кл. С 12 N 9/26, 1972.

Авторское свидетельство СССР

Ф 612955, кл. С 12 Q 1/00, 1978. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к области анализа активности ферментных препаратов и может быть использовано в микробиологической промьппленности.

Цель изобретения — повышение точности ! и сокращение времени определения активности. Сущность способа заключается в нахождении оптимальных концентраций фермент-субстратного комплекÄÄSUÄÄ 1293219 (ю 4 С 12 Q 1/00 С 12 Н 9/00 са, когда ферментативный гидролиэ

0 10-0,f5X-ного раствора растворимого крахмала продолжается от 15 до 45 с.

Смесь гидролизата и раствора йода фотометрируется при длине волны 625 нм и показателем светопропускания служит выходное напряжение фотоприемника, для чего применяется цифровой электронный вольтметр. Такой прием анализа позволяет определять величину активности в 1 мл раствора препарата от 20 до 400 ед, производя всего лишь одно из двух разведений: в 100 или 500 раз. По результатам выходного напряжения находится величина амилолитической активности по заранее построенному калибровочному графику. Способ прост в исполнении, а также и в его автоматизации, может быть использован в микробиологической промышленности и в любой другой, где занимаются анализом активности, d-амилазы. Применение способа увеличивает точность определения и сокращает время анализа. 2 табл.

1293219

40

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для определения амилолитической активности как в готовых ферментных препаратах, так и в технологическом процессе их производства.

Целью изобретения является повышение точности определения амилолитической активности и сокращение време-,®0 ни анализа.

Сущность способа заключается в том, что для определения амилолитической активности используются ниэнцентрации крах вместо 2Х что позволяет.при фотометрировании применять закон ЛамбертаБутера-Бера, а кроме того, проводят .гидролиз субстрата в течение 15-45 с (против 10 мин). Последний прием поз- 20 воляет существенно снизить степень гидролиэа крахмала. В результате кинетика ферментативной реакции может быть математически описана как кинетика 1 порядка. Таким образом, связь выходного напряжения фотоприемника при фотометрировании окрашенного йодом фермент-субстратного комплекса описывается аналогической формулой

А = (1иС + IèК d - 1и 7ц — )

1 U

Kt U

1 t где С, — начальная концентрация крахмала, А — активность фермента, К, константа, U u U — напряжение на выходе фотоприемника при заполнении кюветы водой и анализируемым образцом, d — толщина кюветы, К вЂ” коэффициент поглощения.

Подробное математическое исследование данной формулы показывает, что при фиксированном времени гидролиза и прочих равных условиях, выходное напряжение фотоприемника в достаточном большом диапазоне линейно связано с активностью фермента А = d(U—

- U,). Данное обстоятельство позволяет производить калибровку по двум точкам — сначала фиксируется выходное напряжение фотоприемника при измерении с иммитатором фермента с нулевой активностью (дистиллированная вода), а затем напряжение при измерении фермента — с максимальной активностью.

Систематическая погрешность эа счет нелинейности в этом случае не превышает 57.. Отношение максимальной к минимальной измеряемой активности при одном разведении может достигать величины 16, что определяет существенное преимущество данного способа перед существующими (для которых эта величина равна 2-3), так как практически исключается необходимость повторных измерений иэ-за ошибок в оценке ожидаемой активности ферментного препарата (и степени его разведения).

Hp и м е р 1. В условиях биохимического завода проводят контроль активности амилазы в культуральной жидкости при выращивании Вас.subtilis c помощью предлагаемого способа и сравнивают полученные данные с данными колориметрического способа по ГОСТ

20264.4-74.

Готовят следующие реактивы.

1. О, 157.-ный раствор растворимого крахмала. К 0,75 r крахмала (с учетом влажности) добавить 20 мл дистиллированной воды, тщательно перемешать и внести в 300 мл кипящей дистиллированной воды при постоянном перемешивании; кипятить в течение 3 мин, затем охладить и перенести в мерную колбу на 500 мл, прибавить 20 мл фосфатного буферного раствора с рН

5,6 5,8, довести объем до метки водой.

2. Фосфатный буферный раствор (рН 5,6-5,8). 8,32 г однозамещенного фосфорнокислого калия и 1,9 r двузамещенного фосфорнокислого натрия растворить в дистиллированной воде, перенести в мерную колбу на 1000 мл и довести воцой до метки.

3. Основной раствор йода. 5,5 г кристаллического йода и 11 г калия йодистого растворить в 40 мл дистиллированной воды и довести сфъем водой до 250 мл. Раствор хранить в темной склянке до одного месяца.

4. Рабочий раствор йода. Рабочий раствор йода готовят ежедневно. 20 г калия йодистого растворить в дистиллированной воде, прибавить к нему

2 мл основного раствора йода и общий объем довести дистиллированной водой до 500 мл.

Для определения амилолитической активности разбавляют исходную пробу дистиллированной водой в 100 мл или в 500 раз в зависимости от ожидаемой активности, что позволяет определить активность в пределах от 20 до

400 ед/мл. 1 мл раствора фермента смешивают с 2 мл 0,15-ного раствора растворимого крахмала, смесь выдерживают в течение 15-45 с прн комнатной

1293219 температуре, к 1 мл полученного гидролизата добавляют 5 мл рабочего раствора йода и окрашенный комплекс фермент-субстрат-йод фотометрируют при длине волны 625 нм, причем в качестве показателя светопропускания используют выходное напряжение фотоприемника, а амилолитическую активность определяют по калибровочному графику, построенному в координатах 10

"напряжение на выходе фотоприемникаактивность", начальную точку которого находят по контрольной пробе. Для oIIределения активности в исходной пробе полученный результат умножают на коэффициент разбавления (100 или

500).

Для построения калибровочного графика берут культуральную жидкость с амилолитической активностью 380 ед/мл20 определенной с помощью колориметрического метода по ГОСТ 20264.4-74.

Из исходной пробы методом разбавления дистиллированной водой готовят растворы с различными активностями и для каждого раствора по предлагаемому способу определяют выходные напряжения фотоприемника. Для точки с нулевой активностью в качестве пробы используют воду. Данные измерений сведены 30 в табл.„ 1 и по ним построен калибровочный график.

При определении. активности препаратов грибного или животного происхождения способ измерения и калибровки не изменяется, за исключением того, что используется буферный раствор с другим значением рН (для препаратов грибного происхождения используется ацетатный буфер с рН=4, 7).

Пример 2. В процессе выращивания культуры Вас.subtilis определяют амилолитическую активность. Отбор проб осуществляют начиная с 20 чроста через каждые 4 ч и в конце роста через 2 ч. Пробы разбавляют в

100 и 500 раз, по результатам фотометрирования определяют напряжение

50 на выходе фотоприемника и по калибровочному графику — активность фермента в разбавленной пробе. Активность фермента в культуральной жидкости определяют путем умножения ре55 зультата на коэффициент разбавления (100 или 500) .

Результаты измерений сведены в табл. 2.

Исследонание кинетики реакции гидролиза крахмала при его концентрации О, 07, О, 10 и О, 157. (анализ зависимости оптической плотности, в полулогарифмическом масштабе от времени) позволяет сделать следующие выводы.

Начальный участок всех зависимостей является линейным, подтверждая вывод о том, что на данной стадии кинетика ферментативной реакции может быть описана, как кинетика 1-ro . порядка.

Увеличение концентрации крахмала сверх 0,157. нецелесообразно, так как в начальной точке оптическая плотность будет превышать величину 2, что приведет к появлению нелинейностей из-за отклонений от закона ЛамбергаБугера-Вера и, следовательно, исказит положение "нуля" при калибровке методики.

Использование концентраций крахмала ниже 0 107 также нецелесообразно, так как при этом резко сокращается линейный участок, что приводит к значительному сокращению времени гидролиза и появлению больших временных ошибок при выполнении анализа.

Таким образом, оптимальные начальные концентрации крахмала должны лежать в диапазоне от 0,10 до 0,157..

При этом максимальное значение времени гидролиэа не должно превышать

45 с (т.е. момента отклочения от кинетики 1-ro порядка для концентрации крахмала 0,107). Исходя иэ этих причин, рекомендуется уменьшать время гидролиза не более, чем в 3 раза по сравнению с максимальным, т.е. до

15 с.

Лабораторные испытания методики показывают высокую производительность выполнения анализов (один анализ с подготовительными операциями занимает не более 2,5 мин в то время, как параллельный анализ IIO методике ГОСТ 20264.4-74 занимает с подготовительными операциями и последующими вычислениями по таблицам 2530 мин) и хорошую их воспроизводимость (коэффициент вариации при статистической обработке для 10-кратных измерений из одной пробы культуральной жидкости не превышал 2X).

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения амилолитической активности (до 2/) и избежать повтор1293219

Коэффициент разбавления

Активность

Выходное напряжение, В расчетная, ед/мл

0,48

1490

0,255

0,510

О, 710

0,810

0,89

744

1,44

532

1,75

465

1,96

372

1,02

2,06

Та блица 2

Напряжение, В

КоэффиВремя культивирования ч

Активность в пробе, ед/мл

Активность в культуральной жидкости, ед/мл циент разбавления

0,24

0,9

100

100 1,22

0,40

0,70

1,77

ll 00

0,24.1 20

0,90

500

208

0,42

1,24

500

280

0,56

1,51

500

310

0,62

1,62

500

345

0,69

1,76

500

0,70

350

1,77

500

50 ных определений, характерных для известного способа вследствие необходимости дополнительных разведений, так как соотношение максимальной и минимальной активности при одном разведе- нии может достигать величины 16 (против 2 — 3 по известному способу).

10-кратное уменьшение времени анализа ускоряет проведение определения.

Кроме того, предложенный способ соз- 10 дает основу для автоматизации процесса определения активности амилаз.

Формула изобретения

Способ определения амилолитической активности ферментов путем смешивания пробы с раствором крахмала, проведения гидролиза скрашивания гидролизата раствором йода с последукщим фотометрированием окрашенного комплекса и расчетом ферментативной активности по калибровочному графику, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения активности, используют раствор крахмала с концентрацией О, 17-0, 15 мас.Х, окрашивание пробы раствором йода и фотометрирование осуществляют в момент времени от 15 до 45 с после начала гидролиза °

Т а б л и ц а 1