Штамм @ @ @ продуцент уреазы

 

Штамм Staphylococcus saprophyticus L-l.lO.v. (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетикаУ коллекционный номер ЦМПМ В-3261) продуцент уреазы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н авторскому свидятельствм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3879661/28-13 (22) 04.04.85 (46) 15.11.86. Бюл. ¹ 42 (71) Научно-производственное объединение Фермент (72) С.-Д. Ю. Юодвальките, А.-С. А. Глемжа, И. В. Барейкене, В. А.. Капицкас, В. В. Карпавичюс, В. Б. Ковзан и С. И. Реклайтене (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М- 675986, кл. С 12 N 15/00, 1979.

Авторское свидетельство СССР № 990813, кл. С !2 N 15/00, 1981. (51) < С 12 N 9/78, 1/20//С 12 N 9/78,, С 12 R 1:44 (54) ШТАММ STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS 1.10. к.-ПРОДУЦЕНТ УРЕАЗН (57) Штамм Staphyiococcus saprophyticus L-1.10.v. (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института нВНИИгенетика" коллекционный номер ЦМПМ В-3261) продуцент уреазы.

1270172

Изобретение относится к микробиологической промьппленнасти, а именно к получению нового штамма, используемого дпя получения фермента уреазы.

Целью изобретения является получение нового штамма — продуцента уреазы — с более высокой и стабильной активностью в условиях глубинного культивирования.

Штамм Staphylococcus saprophyt,icus L-1.10,ч. получен путем целевого селекционного отбора наиболее активных вариантов Я1арЬу1асoccus

saprophyticus L-1.10. Установлено, что в пределах морфолагически нераз"лчимых колоний вариантов .наблюдается определенный размах спонтанной изменчивости по признакам биасинтетической активности. Принимая ва внимание возможность стабильного образования уреаэы на "верхних пределах" в результате спонтанной биосинтетической способности образования этого фермента, проводили целенаправленное более детальное изучение естественной изменчивости Staðhóloаoccus saprophyticus L-1,10, С целью отбора возможных более активных вариантов производили рас— сев исходной бактериальной суспензии Staphylococcus saprophyticus

L-I.l0 на агаризованную среду в чажках Петри. Культура оставалась стабильной па способности образовывать характерные ей колонии диаметром 0,5-1,2 мм. Количественную оценку накопления уреазы исследовали в клетках, выращенньгх глубинным способам при 37 С в течение 1ч-16 ч.

Активность вариантов колебалась от

16 до 22 ед/мг сухих клеток. В результате дальнейшей селекционной работы был отобран вариант Б+арЪу1оcoccus saprophyt,icus .-1.10.г.,, стабильно сохраняющий высокий уровень биосинтеза уреазы при многократньгх пересевах, с активностью 21,4 ед/мг сухих клеток. Оптимальный биосинтез уреазы в клетках продуцента происходил при рН среды 5„0-5,2, в та время как оптимальное значение данной величины в клетках исходного штамма равна 6,0-6,5, Более высокий рН благоприятствует поддержанию стериль= . ности во время культивирования.

Штамм Staphylococcus sapropЬу1,xcus L-1,1О.ч,- продуцент уреазы хра< нится в центральном музее культур микроорганизмов института ВНИИгенетика" пад коллекционным номером IJMITM

В-3261.

Морфологические признаки.

Шаровидные бактерии. Ва время логарифмической фазы роста клетки чаще всего образуют пары и тетрады, а позднее, как правило, располагаются поодиночке и нередко создают скопления в виде гроздьев, непадвижньг, спор не образуют. Величина клеток адносуточнай культуры на МПА 0,51,2 мк в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метипавым синим, грампалажительны.

Культурально-физиологические признаки.

На МПА после 24 ч роста при 37 С образуют калении диаметром 0,5-1,2мм.

Колонии серовато-белые непрозрачные гладкие блестящие с правильными краями. После 48-72 ч в центре колоний образуют визуально почти неразличимую выпуклость зеленоватого оттенка.

В MIIB вначале образуют мутность, которая позднее осаждается на дна пробирки. Сред- с-.àíoâèòcÿ и остается ггразрачнай„ На поверхности картофеля не растет.

Штамм является факультативным анаэрабаг с оптимальной температурой раста 37 С. ."рахмал не гидрализует.

Молока не пеп-:.анизирует. Яелатину не разжижает. На среде с минеральным источником азота не растет, Нитратьг восстанавливает в нитриты. Ассимилирует углеводы: мальтазу, глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу, а также глицерин. Не усваигзает арабиназу, ксилоэу, сорбит, рамнаэу, маннит, дульцит и иназит. Устойчив к лизоциму, Содержание Г+Ц оснований в ДНК составляет 30,5-35,0 мол.7. Культура хранится в гграбирках на агаризаван-. най среде пад вазелиновым маслом и в лиофилизираванном состоянии.

II р и м е р. Для хранения и выращивания штамма Б1ьр1гуХососсггз saproрЬуЫсцв .<-1.10.v. используется среда следующего состава, г/л: натрий хлористый 5-0; натрий азотнокислый

2,5; калий фосфорнакислый адназаме- щенный 2-0; ферментативный гидрали:<зат дрожжей 10,0; кукурузный экст- < ракт 40 0.

70172

3 12

Ферментативный гидролизат дрожжей, кукурузный экстракт и минеральные соли суспендируют в 1/5 объеме воды от конечного объема среды, ЗОХ-ным раствором едкого натра доводят до рН 5,0 и прогревают при 90 С в тео чение 30 мин. После охлаждения раствора до комнатной температуры с целью удаления нерастворимых частиц центрифугируют при 400 об/мин в течение 40 мин. Недостаточную жидкость водой доводят до конечного объема среды. Стерилизацию полученного раствора проводят при 135ОС 40 мин.

Для получения посевного материала культуру, хранимую в пробирках со скошенным агаром или под слоем стерильного вазелинового масла при

4 С, высевали на чашки Петри и теро мостатировали в течение 24 ч при о

37 С. Выросшую культуру с чашек пересевали в колбы объемом 750 мл,,содержащие 100 мл среды, и выращивали на качалке (180 об/мин) при 37 С в течение 4-5 ч. Инокулят засевали г в количестве 10 бактериальных клеl ток на 1 мл питательной среды.

Культуру в лабораторных условиях выращивали в колбах объемом 750 мл со 100мл среды на качалке (180 об/мин) при 37 С в течение 16 ч, Культивирование штамма Staphylococcus saprophyticus i;1.10,v. проводили также в 20- и 250-литровых ферментерах с рабочим объемом 10 или 100 л питательной среды соответо, ственно при 37 С в течение 16 ч. Питательную среду применяли такую же, как и в лабораторных условиях. Посевным материалом служили клетки, предварительно выращенные в колбах на качалке в течение 12-16 ч. Фер-... ментацию в 20-литровых ферментерах производили с подачей воздуха 8 л/мин и перемешиванием среды при 120 об/мин

Выращивание в 250-дитровых ферментерах проводили при аэрации 8 м /ч. з

В обоих случаях в качестве пеногасителя испольэовали силикон (5-6 мл/

/10 л среды). Значения рН 5,1 в процессе роста не поддерживали. Каждые

2 ч определяли уреазную активность, начиная с 4-го часа культивирования до конца ферментации (14-16-го часа), Изменение уреазной активности в опытах производили в сухих клетках, обработанных охлажденным ацето-1 ном, Из веса сухих клеток рассчиты5

l0

50 вали уровень уреазной активности на

1 мл культуральной жидкости. Активность уреазы определяли колориметрическим методом с использованием реагента Несслера. За единицу уреазной активности принимали такое количество фермента, в результате действия которого на субстрат выдепяется о

1 мкмоль аммиака за 1 мин при 30 С.

Результаты испытаний предлагаемого и известного штаммов приведены в табл. 1.

Изучение динамики роста и биосинтеза уреазы в клетках нового продуцента, выращенного глубинным способом, показало, что максимальная уре-. азная активность наблюдается после

10 ч культивирования и не меняется до 16-го часа роста.

Из табл. 1 видно, что величины максимальной активности уреазы и веса биомассы клеток Staphylococcus

saprophyticus L-!.10.v °, выращенных как в колбах, так и ферментерах прак тически одинаковы. В .то же время активность уреазы в 1 мп культуральной жидкости и в 1 мг сухих клеток нового штамма приблизительно на 543 превышает активность фермента в исходной культуре. Кроме того, предлагаемый штамм Staphylococcus saprophyticus L-1.10.ч. максимум уреазы накапливает при росте в кислой зоне при рН 5,0-5,2, что облегчает поддержание стерильности во время ферментации.

В конце ферментации биомассу от культуральной жидкости отделяли центрифугированием на проточной центрифуге С-44 при 12000 об/мин. Клет- ки продуцента разрушали механически, используя стеклянные шарики диаметром 0,16-0,3 мм. Полученный экстракт клеток центрифугировали при !

14000 об/мин. В надосадочной жид- . кости измеряли уреазную активность и концентрацию белка. Белок определяли методом Лоури. Ферментный препарат уреазы из клеточного экстрак» та получали путем двукратного переосаждения 3 объемами этилового спирта по отношению к 1 объему экстракта. Полученные данные представяены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, способность к репродукции клеток как нового, так1 и исходного штаммов одинакова. Одна

1270172 тивность в сухом ферментном препарате по сравнению с исходным штамТаблица т

Коли—

Уреазная активность

Способ культиВес сухих кле

Продуцент чество опытов ед/: г сухих клевирования ток жидко сти

Вт,. saprophytocus -1.10,ч.

В колбах 10

21,4+1,6 27,8 1,!

1,3

s aprophyt i c

L- I .! 0

1,31

В колбах 10

12,6+1,0 17,8+1,2

St. яаргорйуСз.cus

7 1,10.v.

19,8 2,1 25,4 2.6

1,3

St. яаргорЬуЫсця

Т-1.10.

12,9 0,9 16,811,3

1,3

То же

St. saprophyticus 1, 10.v.

21, I+1,3 27,3i2,2

В 250-лит- 5

l.3 ровых ферментерах

St. saprophyt.icus

iь-1.1О.

14,0i0,6 18,4+1,1

Таблиц а 2

Уреазная активность

Количестег/мг пре4 парата ед/мг белка массы, г/л во тов

St.. saprophyticus

L-(.10.ч.

96,0+4„,3 115,027,0 320,0=8,0

7,7

St. saprophyticus з!.10

7,7

77,0 3,0 90,0*5,6 280,0."г3,0

ВНИИПИ Заказ 6201/21. Тираж 490 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 ко использование культуры Staphyloсоссия saprophyt icus ь- l .! 0 .v. позволяет на 25% повысить уреазную акВ 10-литро— вых ферментерах ток на

1 мл культуральной в клеточном экстракте ед/мп культур ал ьн ой жидкос ги

Вес сырой био