Способ определения биомассы микроорганизмов в почве

 

Изобретение относится к почвоведению , эхологии, сельскому и коммунальному хозяйству. Цель изобретения - повышение точности определения. Способ заключается в высушивании почвы при 65-70 с в течение 12-24 ч, приготовлении солевой вытяжки (0,5 N K.S04) из высушенной почвы, измерении в ней содержания клеточных компонентов и последующем расчете содержания биомассы микроорганизмов в почве по формуле. Пересчетный коэффициент от содержания клеточных компонентов в солевой вытяжке к биомассе находят в инкубационном эксперименте внесением в данную почву известного количества ассимилируемого вещества. 1 ил., 2 табл. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (})) А1 (5D 4 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н А ВТОРСНОМУ С8ИДЕТЕЛЬСТВУ (57) Изобретение относится к почвоведению, эхологии, сельскому и коммунальному хозяйству. Цель изобретенияповышение точности определения. Способ заключается в высушивании почвы при 65-70 С в течение 12-24 ч, приготовлении солевой вытяжки (0,5 N

К S0 ) из высушенной почвы, измерении в ней содержания клеточных компонентов и последующем расчете содержания биомассы микроорганизмов в почве по формуле. Пересчетный коэффициент от содержания клеточных компонентов в солевой вытяжке к биомассе находят в инкубационном эксперименте внесением в данную почву известного количества ассимилируемого вещества.

1 ил., 2 табл. (21) 4039849/31-13 (22) 21. 03 ° 86 (46) 15.04.88. Бюл. Р 14 (71) МГУ им. М.В. Ломоносова (72) Н.С. Паников, А.Ю. Горбенко, С.А. Благодатский и Е.В. Благодатская (53) 631.46(088.8) (56) Мунблит В.Я. и др. Термоинактивация микроорганизмов. М.: Наука, 1985, с. 202.

Jenkinson D. S., Porolson D. S. The

effects of biocida1 tritments on metabolism in soil, soil Biol. Biochemystry, 1976, v. 8, р. 209-219. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1388802 где х— е иеК

40 е ие к

С =С„+ С„.+ С о

Изобретение относится,к почвоведению, сельскому и коммунальному хозяйству и может быть использовано для количественной оценки микробной биомассы при характеристике плодородия

5 почв, а также при проведении санитарного контроля за состоянием природных объектов.

Целью изобретения является повышение точности способа определения.

На чертеже приведена кривая дина,мики образования растворимых органических соединений В в серой лесной почве.

Способ заключается в том, что в качестве биоцидной обработки почвы (, используют ее высушивание при 65О .70 С в течение 12-24 ч, содержание клеточных компонентов определяют 20 сразу после завершения биоцидной, обработки в солевой (0,5 N К SO<) вытяжке из почвы, коэффициент пересчета К находят в инкубационном эксперименте с внесением В данную почву известного количества ассимилируемого элемента по уравнению материального баланса, а расчет производят по формулам и и и х= (е-е „) /К, К= (е — e „-å+å „) / (E-e Ä-(Р-Р ) биомасса микроорганизмов в мкг углерода/г почвы; содержание углерода в солеВОЙ Вытяжке из. пОчВы cooTBe f ственно до (контроль) и после высушивания-регидратации, мкг углерода/г почвы; содержание углерода в этой же вытяжке из проинкубированной почвы соответственно до и после высушивания-регидратации, мкг углерода/г почвы;

Š— исходное количество вносимой в почву глюкозы, мкг/г почвы;

P — количество углерода в составе внеклеточных продуктов обмена почвенных микроорганизмов, мкг/г почвы.

Высушивание при умеренно высоких температурах избирательно действует на живые микроорганизмы, нарушает барьер проницаемости клеток вследствие денатурации цитоплазматических мембран, при этом мертвое органическое Вещество не разрушается. В ходе последующей регидратации (встряхивание высушенной почвы с разбавленным солевым раствором) внутриклеточное содержимое микроорганизмов переходит в жидкую фазу и может быть определено с помощью стандартных аналитических методов. Режим высушивания был избран о исходя из того, что при 70 С не происходит сколько-нибудь заметного разрушения мертвого органического вещества, но в то же время клетки микроорганизмов эффективно обезвоживаются. Как видно из чертежа, через

12 ч высушивания достигается максимум выхода анализируемых соединений. Дальнейшее увеличение срока высушивания до 24 ч нескольких суток не сопровождается заметным увеличением солюбилизации микробной биомассы. Высушивание-регидратация приводит к солюбилизации не всех, а только части клеточных компонентов. Доля переходящих в раствор клеточных компонентов как раз и есть по своему физическому смыслу пересчетный коэффициент К.

Величина К варьирует в достаточно широких пределах у различных микроорганизмов и даже у одного и того же микроорганизма в зависимости от его физиологического состояния. Поэтому разные почвы, различающиеся по составу микробного сообщества, характеризуются и разным численным значением К. Для прямого нахождения К необходимо вносить в образец почвы известное количество легкодоступного субстрата, содержащего ассимилируемый элемент (С, N, P, К и т.д.), и затем инкубировать почву в благоприятных для роста микроорганизмов условиях температуры и влажности. Элемент внесенного в почву субстрата ли.бо остается непотребленным, либо утилизируется микроорганизмами, включаясь в состав микробной биомассы и внеклеточных метаболитов ° Их количества связаны между собой уравнением материального баланса. В качестве примера приводим уравнение материального баланса по углероду для случая внесения в почву глюкозы где С, — углерод, вносимый в почву глюкозы;

С з — углерод остаточного количества глюкозы (при химичес1388802 ком анализе водной или солевой вытяжки из почвы в эту фракцию часто попадают также продукты брожения или неполного окисления глюко5 зы);

С„ — углерод, выросший на глюкозе микробных клеток;

С вЂ” углерод внеклеточных продуктов обмена, главным образом СО .

Все перечисленные величины могут быть легко измерены, что позволяет найти количество углерода новообразо- 15 ванной биомассы по разнице: С „ =

С,— С р.

В результате роста микроорганизмов на глюкозе увеличивается и количестВО органических ВещестВ, перехо- 20 дящих в солевую вытяжку после высушивания-регидратации.

Если обозначить прирост количества

С в солевой вытяжке из почвы по сравнению с контролем в момент внесения субстрата д С, то величину К можно найти по формуле дС»- дС, К— Ф

С-5, С-з» С р» прирост количества С в со- 30 левой вытяжке через t cyгде дс» ток;

С и С вЂ” количество углерода в сос-5» таве соответственно остаточного субстрата и СО в момент времени t, Аналогичным образом можно найти величины К для других элементов, например N. В этом случае соединение азота необходимо вносить вместе с 4g источником С и энергии, для того чтобы вызвать ощутимый прирост биомассы микроорганизмов.

Вместе с тем необходимо учитывать и то, что в инкубационном экспери- 45 менте нежелательно очень большое увеличение биомассы, так как это существенно искажает состав исходного микробного сообщества. Цет необходимости устанавливать величину К в каждом определении, для данной почвы это достаточно проделать однократно.

Пример 1. Определение количества микроорганизмов в почве фумигационным методом. 50 г серной лесной почвы (влажность 19,17, свежеотобранные образцы) просеивают через сито с отверстиями 3 мм, помещают во флакон емкостью 500 мл и обрабатывают парами хлороформа в течение

24 ч в эксикаторе. После этого пары хлороформа удаляют 3-кратным вакуумированием эксикатора, флаконы с почвой герметично закрывают резиновыми пробками и инкубируют в течение 10 дней при 25 С. Затем в обработанном и в контрольном образцах почвы определяют количество выделившегося СО2 по концентрации СО в газовой фазе.

Концентрацию СО2 определяют на газовом хроматографе ПМ-8 МД с катарометром в качестве детектора. Результаты -определения: 120 мкг С-С02 в опыте, 74 мкг СО -С в контроле, разность составляет 46 мкгС/г почвы.

Принимая коэффициент пересчета равным 0,41 получают количество микробной биомассы 112,2 мкгС/г почвы.

Пример 2. Определение биомассы микроорганизмов методом регидратации. 50 r свежей серой лесной почвы, предварительно просеянной через сито с ячейками 3 мм, помещают в конические колбы емкостью 300 мл и высушивают в сушильном шкафу при о

70 С в течение 18 ч. Одновременно контрольный образец (без прогрева) заливают

0,5 N раствором K2SO (соотношение почва:вытяжка =. 1:2) и взбалтывают на качалке 30 мин. Суспензию фильтруют через крупнопористый фильтр, вытяжку хранят до анализа в холодильнике при 4 С в течение 18 ч. Из высушенной почвы готовят вытяжку аналогичным образом. Затем в вытяжке определяют количество органического углерода методом бихроматного окисления с использованием глюкозы в качестве стандарта. Результаты определения: 112,7 мкг С/г почвы в высушенном образце и 26,0 мкг С/г почвы в контроле. Увеличение содержания углерода, вызванное прогревом, составляет в данном примере 86,7 мкг С/r почвы.

Для определения коэффициента пересчета В почву вносят глюкозу в количестве 2 мг C/ã почвы и инкубируют при 25 С при постоянной влажности

20 Вес.Е во флаконах, закрытых резиновыми пробками. Р момент внесения и на 1-4 сутки инкуба, в почве определяют остаточное сод... ание С в солевой вытяжке и измеряют количество

СО в воздушной фазе флаконов. Парал2 лельно определяют количество С в со02 6

5 t,3888 левой вытяжке из почвы после высушивания.

В табл.1 представлены результать. определения.

Коэффициент пересчета К находят для каждого срока инкубации па форМуле е"-е,-(е-ек)

К

Е-е"„- (P-Р„)

1Î

Среднее значение К оказалось равным 0,25. Биомассу микроорганизмов почве х рассчитывают по формуле х=(е-е )/К=347 мкг С/г почвы.

Пример 3. Определение С B со-1 5

Левых вытяжках высушенной и контролькой почв производят по примеру 2.

Для нахождения коэффициента пересчета

Йавеску почвы 1 r помещают в пенициллиновые флаконы и вносят 0,2 мл раст- 20

Вора, содержащего 5 мг С-глюкозы

14 (исхадная активность 80 mCi) r и инКубируют при комнатной температуре.

Через 1,6, 28 и 7? ч определяют содерн жание С в солевой вытяжке да и пас- 25 ле высушивания. Поспе этого определяЮт количество иммабилизаванного С 4

Путем бихроматнога окисления.

В табл.2 представлены результаты

Определения. ЗО

Среднее численное значение К оказалась равным 0,27. Биомасса микроорганизмов в почве, рассчитанная па

Формуле примера 2, равна 3?1 мкг С/г почвы, Пример 4. 50 г свежей серой леской почвы помещают во флакон емкостью 500 мл, вносят глюкозу в количестве 2 мг С/r поч)зы и инкубируют о в течение суток при 25 С„ Затем апре- 10 еляют биомассу по примеру 1. Резульаты определения — 1530 мкг С-СО в

2 опыте и 1810 мкг С-СО,, в контроле, разность составляет отрицательную

:величину, т.е, фумигационный метод непригоден для определения биомассы микроорганизмов в обогащенных почвах.

Пример 5. Поч зу инкубируют глюкозой по примеру 4. Затем определяют биомассу микроорганизмов заявленным методом па прииеру 2. Результат определения: 590 мкг С/г почвы в высушенном образце, 120 мкг С/r почвы в контрольном,, Биомасса микроорганизмов, выросших на глюкозе, рас-..читанкая па примеру ?, составляет

1850 мкг С/г.

II р и м е р 6, Берут свежие образцы кислой (рН водной зытяжки 4,5) слабоокультуренной дерново-подзолистой почвы под кукурузой и проводят определение по примеру 2. Содержание микробной биомассы составило 71 мкг С/

/г почвы.

Пример 7. Определение биомассы производят па примеру 2, но в друо гам режиме высушивания: при 65 С, время выдерживания образцов в сушильном шкафу 24 ч. Содержание микробной биомассы составило 328 мкг С/r почвы.

Пример 8. Берут свежие образцы серой лесной почвы и проводят определение по примеру 2 за исключением того, что в солевых вытяжках вместо определения органического С измеряют содержание углеводов с фенолсернокислай смесью. Результаты определения: до высушивания содержание углеводов в солевой вытяжке 16 мкг С/г почвы, после высушивания — 32,4 мкг С/r почвы. Используя коэффициент пересчета, найдекный в примере 2, получаем, что содержание углеводов микробной биомассы равно бб мкг С/r почвы.

Пример 9. Определение прово-. дят по примеру 2 за исключением того, что вместо органического углерода в солевых вытяжках измеряют содержание общего азота методом сжигания в серной кислоте с Se-катализатором.

Для определения пересчетнога коэффициента почву инкубируют па примеру 2, но с дополнительным внесением

Са(NO )z в количестве 0,2 MKr N/г и измеряют содержание общего N в солевой вытяжке в начале инкубации и через двое су-ток„ до и после высушивания. Величина К, рассчитанная по формуле: К=(е -е„-е+е„)/(E-e „), оказалась равной 0,48. Используя найденный коэффициент пересчета, получаем, чта содержание азота в микробной биомассе равно 65 мкг N/г почвы.

Выбор конкретного химического анализа клеточных компонентов, переходящих в раствор после высушивания-регидратации, диктуется конкретными задачами исследования, Так, при изуче— нии круговорота углерода в экосистемах очевидна целесообразность определения микробной биомассы по С, а при изучении превращений азота — no N и т.д, При выборе конкретной модификации способа нужно учитывать также, чта процентное содержание углерода в клетках микроорганизмов подвержено значительно меньшему варьированию па

1388802 сравнению с содержанием N, P . К и других элементов. С другой стороны, определение микробной биомассы по азоту имеет то преимущество, что отношение (е-е )/е„ достигает наи5 большего значения. Это, безусловно, благоприятно сказывается на воспроизводимости результатов.

Определение углеводов, также как белков, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, липидов и других соединений представляет интерес с точки зрения усредненной характеристики химического состава микроорганизмов в данной почве, и, возможно, найдет применение при определении биологической активности и индикации почв. По сравнению с прототипом (фумигационным методом) предлагаемый способ значительно быстрее (результаты определения становятся известны через сутки, вместо 10-20. сут. по прототипу) при меньшей трудоемкости определения и не требует вредных для здоровья реактивов. Предлагаемый способ также более точен, так как он позволяет более строго оценить численные значения коэффициента пересчета к биомассе и исключает неопределенность в отношении контрольного измерения. Лучшая воспроизводимость способа обусловлена тем, что он предусматривает меньшее число операций (высушивание, получение солевой вытяжки, химический анализ) по сравнению с прототипом (фумигация, удаление паров фумиганта, инкубация. образца почвы, химический анализ) и тем, что при исключении долгосрочной инкубации уменьшается влияние неконтролируемых

1 факторов на результаты определения.

Наконец, предлагаемый способ из-за исключения инкубации становится универсально применимым для любых почв независимо от реакции среды, содержа45 ния карбонатов и органических ве» ществ.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения биомассы микро организмов в почве, предусматривающий

1 биоцидную обработку образца почвы, измерение содержания углерода, обра" зуемого из поврежденных клеток микроорганизмов, определение пересчетного коэффициента и количества биомассы расчетным путем, о т л и ч а юшийся теМ, что, с целью повышения точности определения, биоцидную обработку почвы осуществляют высушиванием при 65-70 С, перед измерением содержания углерода из образца почвы готовят солевую вытяжку, измерение углерода проводят в солевой вытяжке, определение лересчетного коэффициента осуществляют путем инкубапии дополнительного свежего образца почвы в присутствии глюкозы в количестве 0,0002.5 мг/г почвы при полевой влажности, измерения остаточного содержания внесенной глюкозы и расчета по формуле е -е (е-е ) и н к

К=- — — — ——

К- "-(P-Р„) где е — содержание углерода в солек вой вытяжке из нативного об" разца почвы; е — содержание углерода в солевой вытяжке из почвы после высушивания-регидратации, мкг/г почвы; и и е и е — содержание углерода в солевой вытяжке из проинкубированной почвы соответственно до и после высушивания-регидратации, мкг/г почвы;

Š— исходное количество вносимой в почву глюкозы, мкг/г почвы;

P u P — количество углерода, образук емого из поврежденных клеток микроорганизмов в проинкубированной и контрольной .почве соответственно, мкг/г почвы, а определение количества биомассы осуществляют по формуле (е-е ) х

10

1388802

Таблица1

Обогащенная почва

Почва без внесения глюкозы

С в солевой

Со мкгС

С в солево вытяжке вытяжке, мкгС, г почвь (Р) r почвы

1 2 (e„) 1 " 2** (ем) (e ) О

0,34

120 594 81 О 22 193 10

100 334 1310 33 188 20

0,11

75 309 1540 12

94 31

0 35

60 248 1660 20 202 41

0i22

1 — до высушивания-регидратации;

** 2 — после высушивания регидратации.

Таблица 2 и и е ° -е„, имп/мин

Е-е -P, и имп мин

1 66140 137122 О, 33

6 71887 133487 О 35

28 73842 234637 0,24

72 43068 201225 О, 18

Время инкубации, сут

2026 1354 О 25 81

Время инкубации, ч

С02 Ь мкгС г почвы

1388802

РО

1 7 3 0 Я

Составитель Л. Борисова

Техред А.Кравчук

Редактор Т. Парфенова

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 1576/47 Тираж 847

ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Юремя бь еуши8амия, 4(Корректор С. Шекмар

Подписное