Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к дифференцировочному антигену в-лимфоцитов человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики лейкозов и лимфом человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muskulus, продуцирующего моноклональные антитела (НА) к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов, характерному для стадии антиген-зависимой дифференцировки. Штамм ID7 получают гибридизацией спленоцитов мьпией BALB/C, иммунизированных клеточнойлинией RPMI-1788, с клетками миеломы РЗ-ХбЗ- Ag 8.653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 76 D и характеризз -ется следующими признаками. Среда культивирования - среда RPMI-1640 или MEM - в модификации Дальбекко с 10% эмбриональной телячьей сьшоротки, посевная доза клеток - 100 тыс.кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:7. Секреция .моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет t5-20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мкг/мл .асцитической жидкости. Ж относятся к классу IgGI и выявляют дифференцировочный антиген В-лимфоцитов человека на антиген-зависимой стадии дифференцировки. МА используются для диагностики ликфоцдных форм лейкозов и лимфом, 2 табл. i 00

СОаЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ ЕСПУЬЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4145194/31-13 (22) 03.09.86 (46) 30.07. 89. Бюл. Р 28 (71) Институт проблем онкологии им. P.Å. Кавецкого (72) Е.П. Ветрова и С.П. Сидоренко (53) 578.085.23(088.8) (56) Каза К., Koshiba Н, Ishii 3., Kukuchi К. А monoclonal. antibody

human В cell differentiation

antigen (HLB-1 antigen) Microbiol

Immunol 1983, 27, 1, 51-64. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК EHBOYHbE MUS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОЙАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К,ДИфФЕРЕНЦИРОВОЧНОМУ АНТИГЕНУ В-Н4МФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики лейкозов и лимфом человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muskulus продуцирующего моноклональные антитела (МА) к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов, характерному для

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики лейкозов и лимфом человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток жиBQTHblx Mus Musculus, продуцирующего моноклональные анти-. тела (МА) к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов, характерному для 51) 4 С 12 N 5/00, А 61 К 39/00

2 стадии антиген-зависимой дифференцировки. Штамм ID7 получают гибридизацией спленоцитов мышей BALB/С, иммунизированных клеточной линией

RPMI-1788, с клетками миеломы Р3-Х63Ag 8.653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматичсских клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)

76 D и характеризуется следующими признаками. Среда культивирования— среда КРАП-1640 или MEM — в модификации Дальбекко с 10Х эмбриональной телячьей сыворотки, посевная доза клеток — 100 тыс.кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:7. Секреция моноклональных

40 антител на 3-4 день культивирования составляет 155-20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мкг/мл .асцитической С жидкости. ИА относятся к классу IgGI и выявляют дифференцировочный антиген

В-лимфоцитов человека на антиген-зависимой стадии дифференцировки. MA фри используются для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом. 2 табл.. М

Об стадии антиген-зависимой дифференцировки.

Штамм ID7 получают следующим образомм., Мьппей линии BALB/ñ иммунизируют клеточной линией BALB/с- t 788 -лимфоцитов периферической крови человека, трансформированных вирусом Энштейна-Барр.

3 13892

При этом мышей иммунизируют 3 разя внутpJI6p!oltIHHHo H 1 раз внутривен но (от 2, 4 до 10, до 15 ° 10 клеток с интервалами 1, 4, 4 и недели) .

Через 4 дня после внутривенной иммунизации проводят соматическую гибридизацию с помощью 50!, полиэтиленгликоля м. м, 1500 клеток селезенки с клетками миеломы РЗ вЂ” Х63-Ag 8, 653.

Клетки разливают в 96-луночные пластиковые плоскодонные план >еты. Для культивирования гибридных клеток HB первых этапах используют среду МЕМ в модификации Дальбекко с 15i. лошадиной сыворотки, После слияния в культуры клеток в течение двух недель добавляют НАТ-среду (конечная кон-7 центрация гипоксантина 10 М, ами-7 -5 ноптерина 4х10 М, тимидина 1, бх10 М), 20 а затем в течение одной недели ИТсреду.

После селекции гибрицов в ИАТ- и

11Т-средах рост клоков гибридом выявляют в 133 из I92 лунок, Скрининг 25 специфической аитительной активности проводят методом иммунофлуоресценции в непрямом варианте на монослое живых клеток. Клетки прикрепляют на предметные стекла,.обраоотанные раство- 30 ром поли-L-лизина (100 ) мл, м.м.

40000-80000) . При иммунофлуоресцентном анализе суперна антов гибридом спе цифическая аитите и ьная активность обнаружена в 38 лунках, а при клонировании способнос-ь синтезировать антитела к клеткам RPNI-1788 сохраняют 18 клонов гибридом. Клонирование методом лимитирующих разведений проводят 2 раза с использованием перитонеальных макрофагов мыше" BALB/ñ в качестве ф-щера. После реклонирова— ния и пассирования in vitro отбирают клон гибридом ID7, клетки которого активно продуцируют антитела к поверх45 ностным антигенам клеток линии RPMI.1788. Штамм ID7 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером

ВСКК(П)760 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. По цитоморфологическим признакам клетки

ID7 являются плазмобла-тами со средне-высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, базофильной цитоплазмой

Ф грубой структурой хроматина.

84 4

Культуральные признаки. Среда куль-, тивирования — cpena RPIII-1640 или МЕМ в модификации Дальбекко с 102 эмбриональной телячьей сыворотки, MML ãëóтамина, 100 мгк/мл гентамицина при

37 С в атмосфере 57 СО, оптимум рН

Э б, 8-7, 5.

При росте на пластике клетки образуют пло íûé монослой . К стеклу клетки прикрепляются слабо и в стеклянных флаконах ра.стут как в монослое, так и в суспензии. Посевная доза клеток 100 тыс,кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:7.

Культивирование в организме животных. Для получения асцита пригодны лишь мыши BADÂ/ñ. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5х 10 а клеток в 5 мл среды, асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мкг/мл асцитной жидкости. Продукция

NA сохраняется до 20 пассажей in го и до 3 пассажей на животных.

Биохимические признаки. В цитоплазме клеток не обнаружена активность ферментов пероксидазы и щелочной фосфатазы. Активность кислой фосфатазы и кислой неспецифической эстеразы в клетках гибридомы in vitro значительно ниже, чем в клетках, использованных для гибридизации, в то время как активность неспецифической эстеразы более выражена, чем в имму— нобластах селезенки. Активность этих ферментов в гибридных клетках, культивируемых in vivo, очень слабая, практически отрицательная.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела, секретируемые клетками штамма ID7 относятся к классу IgGI и выявляют дифференцировочный антиген В-"лимфоцитов человека на антиген-зависимой стадии дифференцировки.

Контаминация. При длительном наблюдении и посевах на питательные среды бактерии и грибы в культуре не обнаружены.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживаются в эмбриональной телячьей

Линии клеток

Число положительных клеток

51,2

43,8

34,5

66,7

24,0

34,0

0

Таблица 2

Взаимодействие MA с клетками крови в норме и при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях

Количество положительно

Минимальное и максимальное содержание антиген-положиИсследуемый материал реагирующих случаев к общему количеству наблюдений тельных клеток, 7.

Клетки здоровых людей: мононуклеары периферической крови гранулоциты крови клетки костного мозга

0/11

О/7

О/2

0-1, О

О

1 — 1,5

Мононуклеары периферической крови после стимуляции РЫМ 6/6

7, 5-34, О

4/8

8, 0-10,0 хроническом тонзиллите

5 13 сыворотке с добавлением 107. диметилсульфоксида. Режим замораживания следующий: 4 С в 1 мин до 4 С, затем о о

1 С в 1 мин до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане о при 37 С, жизнеспособность клеток после размораживания 70-80Z по окрашиванию трипановым синим.

Пример . Методом иммунофлюоресценции исследуют специфичность MA на 11 линиях клеток человека, клетках

11 здоровых людей, 14 больных острым лимфобластным лейкозом, 8 больньж лимфогранулематозом, 8 больных миеломной болез нью, клетках 10 миндалин детей с хроническим тонзиллитом и клетках периферической крови 10 здоровых лиц,бласттрансформированных в культуре in vitro митогеном лаконоса (Р1И) . Результаты исследования представлены в табл.1 и 2.

Результаты, приведенные в табл.1 и 2, свидетельствуют о том, что полученные МА являются В-специфическими и не реагируют с Т-клеточными линиями линией К-562, антигенами мононуклеаров и гранулоцитов периферической крови здоровых людей, клетками костного мозга. В то же время у 3 из

8 больных лимфогранулематозом число клеток, связывающихся с антителами, достигает 18,0-49,07 и антитела моКлетки миндалин детей при

89284

6 гут быть рекомендованы для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом.

Формула из об ре те ния

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II)

¹ 76D, используемый для получения моноклональных антител к дифференцировочному антигену  — лимфоцитов челове10

Таблица 1

Взаимодействие NA с клетками различных линий (число положительных кле ток, 7.)

20 В- клеточные линии:

RPMI-1 788 7

PHS

GR0

Daudi

25 Nama 1 va

Raj i

Ramos

Т-клеточные линии:

Mol t-4

30 CCRF-HSB2

Jurkat

Ни-Т, ни-В-клеточная линия:

К-562 389284

Продолжение табл 2

Клетки крови больных: хроническим лимфолейкозом; острым лимфобластным лейкозом миеЛомной болезнью

8,0-14,6

2/13

2/16

1/8

5, 7-10, 0

16,5

Клетки лимфатических узлов больных лимфогранулематозом

3/8

18,0-49,0

Составитель М. Серова

Техред Л.0лийнык . - Корректор В.Гирняк

Редактор Н. федорова

Заказ 4908 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101