Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент нейтральной протеиназы

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3697. Цель изобретения - получение нового штамма - продуцента нейтральной протеиназы, специфически расщепляющей актин. Бактерии выращивают на средах, приготовленных на основе мясного настоя или экстракта . Максимальная протеолитическая активность достигается через 4-5 суток . Полученный фермент расщепляет актин с образованием только одного стабильного фрагмента с молекулярной массой 36 кД. Другие белки этим ферментом не расщепляются.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК,;SU 90241 (51) 4 с 12 N9 (c 12 N ц >

С 12 R 1:19) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛ СТВУ

Ь (21) 4 146739/31-13 (22) 14. 11.86 (46) 23.04.88. Бюл. У 15 (71) Институт цитологии АН СССР (72) С.IO.Хайтлина, Т.Д.Смирнова, З.Ф.Федорова и А.М.Усманова (53) 577.15(088.8) (56) Endo Т., Masaki Т., Biochem.

Biophys. Res. Comm. 1982, 107, р. 146 7-14 74 °

Mornet D., Ue К. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 1984, 81, р. 3680. 3684. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI — ПРОДУЦЕНТ НЕЙТРАЛЬНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий Escherichia coli

ВКПМ В-3697. Цель изобретения — получение нового штамма — продуцента нейтральной протеиназы, специфически расщепляющей актин. Бактерии выращивают на средах, приготовленных на основе мясного настоя или экстракта. Максимальная протеолитическая активность достигается через 4-5 суток. Полученный фермент расщепляет актин с образованием только одного стабильного фрагмента с молекулярной массой 36 кД. Другие белки этим ферментом не расщепляются.

1390241!

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Escherichia cali ВКПМ

В-3697.

Цель изобретения — получение нового штамма — продуцента протениазы, специфически расщепляющей актин.

Протеиназа, полученная из штамма

Kscherichia coli ВК11М В-3697, расщепляет актин с образованием только ! одного фрагмента, не подвергающегося дальнейшему расщеплению. Другие белки эта протеиназа не расщепляет.

Штамм Escherichia coli ВКПМ

3-3697 выделен из раствора, применяемого для выделения актина, на биостанции "Восток" Института биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР. 20

Штамм имеет следующую характеристику.

На различных средах штамм образу ет палочковидные клетки, располагающиеся поодиночно или в коротких 25 цепочках. Палочка подвижна, имеет капсулу. Клетки грамотрицательны.

Клетки растут на плотных и жидких средах, приготовленных на основе мясного настоя или экстракта. Темпера- 30 о турный оптимум — 37 С, растут при

22, при 4 и 40 С роста нет.

Сохраняет жизнеспособность и ферментативную активность при хранении о при 4 С. Разлагает глюкозу с образованием кислоты и газа, индол и сероводород не образует.

Ферментирует мальтозу, маннит, сахарозу, сорбит, ксилозу, крахмал.

Не разлагает дульцит, лактозу, рам- 10 нозу, инозит, адонит, салицин, мочевину.

Образует каталазу. Превращает нитраты в нитриты. Не патогенен.

° 45

Культивирование клеток Escherichia

coli BK1IM В-3697 проводят в колбах о емкостью 250-500 мл при 28 и 37 С в течение 2-7 сут. Среда для культивирования: триптический перевар бычьего сердца, плацентарный бульон (настой плаценты) или аминопептид, - рН 7,0-7,2. В течение суток культура находится в логарифмической фазе роста, затем выходит на стационарную фазу. Конец культивирования определя-55 ют по максимуму эндогенной фермента- . тивной активности, который достигается на 4-5 сут роста.

Ферментативную активность определяют по перевариванию актина. Бактерии разрушают ультразвуком или несколькими циклами замораживания— размораживания. Клеточный экстракт осветляют центрифугированием и добавляют к раствору актина. Смесь ино

«убируют при 20 С и подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

О величине ферментативной активности судят по интенсивности зоны на геле, соответствующей стабильному фрагменту актина с мол. массой 36 кД.

Пример 1. Для выращивания бактерий в колбу емкостью 500 мл, содержащую 250 мл настоя плаценты, вносят инокулят — суточную культуру

Е.coli (А-2) ВКПМ В-3697р выросшую на той же среде, из расчета 1 мл культуры на 100 мл свежей среды. Культивирование проводят в термостате при 37 С в течение 5 дней.

Ежедневно из колбы отбирают 10 мл бактериальной культуры для определения количества клеток и ферментативной активности. О количестве бактерий в отобранных пробах судят по оптической плотности суспенэии приЯ =

=600 нм, количеству колоний, выросших н;, твердой среде, и концентрации общего белка в бактериальном экстракте.

Для определения ферментативной активности клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в 3 мл раствора для экстракции актина (О 5 мМ

АТФ, 0,2 мМ СаС1, рН 7,5) и разрушают 3 циклами замораживания — размораживания. Полученный экстракт осветляют центрифугированием при 12000 об/

/мин в течение 40 мин.

К 1 мл раствора, содержащего актин, с концентрацией общего белка

1 мг/мл добавляют равный объем бактериального экстракта с концентрацией общего белка 1 мг/мл. Смесь инкубио руют при 20 С в течение 1 ч и анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. На электрофореграмме видно, что исходный препарат актина содержит одну белковую зону. После добавления бактериального экстракта интенсивность этой зоны уменьшается, и в препарате появляется вторая зона, соответствующая фрагменту. актина мол. массой 36 кД. Количе1390241 из Escherichia coli ВКПИ В-3697 мл бактериального экстракта, полученного по примеру 1, с концентрацией белка 1 мг/мл инкубируют с 1 мп разведенных в воде до концентрации 1 мг/мл следующих белков: казеин, альбумин, овальбумин, лизоцим, РНКаза, гистон

Н2В, тропомиозин, тропонины, С, I и II смеси инкубируют в течение 1 ч о о при 20 С и в течение 1 сут при 4 С.

Результаты реакции анализируют электрофоретически. В то время, как актин за 1 ч инкубации при 20 С полностью о превращается во фрагмент с мол.мас-. сой 36 кД, другие белки не расщепляются. Это означает, что актин является единственным субстратом протеиназы А-2.

| ство фрагмента при добавлении экст" ракта 1-суточной культуры 207 от количества актина. Экстракт 2-суточной культуры расщепляет 50Х исходного актина. Полностью актин превращается во фрагмент при добавлении экстракта 4-суточной бактериальной культуры.

Таким образом, бактерии штамма

Escherichia.coli BKIIH В-3697 синтези-10 руют расщепляющую актин протеиназу на стационарной фазе роста культуры. .П р и и е р 2. Дпя получения фрагмента .актина и определения его стабильности инкубацию актина с бактериальным экстрактом иэ 4-суточной культуры (как описано в примере 1) проводят.в течение разных промежутков времени (от 40 мин до 24 ч). Продукты протеолиза так же, как в примере 1, анализируют электрофоретически.

На электрофореграмме видно, что при всех сроках инкубации образуется только один фрагмент актина с мол. массой 36 кД. Дополнительных зон при 25 увеличении времени инкубации не образуется. Количество фрагмента при увеличении срока инкубации не уменьшается. Это означает, что фрагмент стабилен и не деградирует на фрагмен-3О ты меньшей молекулярной массы.

Таким образом, при инкубации актина с протеиназой из бактериального штамма Escherichia coli ВКПМ В-3697 образуется один фрагмент актина, не подвергающийся дальнейшему протеолизу.

Пример 3. Для определения субстратной специфичности протеиназы

Таким образом, штамм Escherichia

coli BIGIM В-3697 является продуцентом протеиназы, специфически расщепляющей один из основных белков мьшщ и цитоскелета актин с образованием стабильного фрагмента с мол.массой

36 кД, что позволяет использовать этот штамм для получения протеиназы — удобного инструмента для определения структуры актина и его свойств в составе сократительного аппарата клетки.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli

ВКПМ В-3697 — продуцент нейтральной протеиназы.

Составитель Т.Мелентьева

Редактор Н.Гунько Техред М.Ходанич Корректор А.Зимокосов

Заказ 1736/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, .4