Рекомбинантная плазмидная днк рсек 10,кодирующая синтез фрагмента кленова днк-полимеразы 1 е.coli,и способ ее конструирования
СоаЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУВЛИК
А1 (бП 4 С 12 И 15/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4073635/28-13 (22) 02.06.86 (46) 30.04.88. Бюл. ¹ 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии и Институт цитологии и генетики
СО АН СССР (72) В.В.Кравченко, Л.А.Петренко, С.Х.Дегтярев, Н.А.Нетесова, M,È.ÐèBêèí и К.Д.Кузнеделов (53) 575.224.2:577.2/048/(088.8) (56) PNAS, 1983, v. 80, р. 1830-1834. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК
РСЕК10, КОДИРУЮЦАЯ СИНТЕЗ ФРАГМЕНТА
КЛЕНОВА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ I Е.СО I И
СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии.
Цель изобретения — повышение уровня синтеза фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli. На основе векторной части плазмиды pCEZ12 и фрагмента
BamHI-PstI плазмиды pCI55, содержащего последовательность нуклеотидов, „„SU „„1392094 кодирующую синтез фрагмента Кленова
ДНК-полимеразы I Е.coli (ФК), сконструирована рекомбинантная плазмида рСЕК 10 размером 7,21 т.п.о. Плазмида позволяет получить штаммы-продуценты с повышенным уровнем синтеза ФК (не менее 375000-470000 ед. акт. на
1 r сырого веса биомассы клеток). Последовательность, кодирующая синтез
ФК, находится под контролем промотора
Р, регулируемого встроенным е плазмиду геном термочувствительного репрессора с1857. Двойной селективный контроль обеспечивается генами устойчивости к ампициллину (Ь1а) и тетрациклину (tet). Плазмида не содержит дополнительных фаговых генов, понижающих ФК, и не требует специального штамма Е. coli. Правильность ориентации последовательности, кодирующей С
ФК, относительно промотора Р и восстановление целостности гена Ь1а при сборке обеспечивается направленным клонированием фрагмента в векторе.
2 с.п. ф-лы, 2 ил., i табл.
1392094
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой ре° комбинантную плазмидную ДНК обеспе9
5 чивающую синтез фрагмента Кленова
ДНК-полимеразы Х Е.cali и способ конструирования данной рекомбинантной плазмидной ДНК.
Цель изобретения — повышение уров- 10 ня синтеза фрагмента Кленова ДНКполимеразы Т E.coli..
Повышение синтеза обеспечивается за счет того, что сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК рСЕК 10 15 размером 7, 21 т.п.о., состоящая из векторной части рекомбинантной плазмидной ДНК pCEZ 12 длиной 3,50 т,п.о. и чужеродного фрагмента рекомбинантной плазмидной ДНК pCI 55 размером 20
3,71 т.п.о., имеющая уникальные сайты рестрикции XhoI, PstI, Sal GI, BamHI, ClaI, ген с1857 фага Л для автономного, штаммонезависимого синтеза термочувствительного рейрессора, 25 последовательность нуклеотидов, кодирующую фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е.cali, промоторно-операторную область Р /Р ДНК фага Л 9 обеспечивающую регулируемую репрессором 30 транскрипцию гена с1857 и последовательности, кодирующей фрагмент ДНК- полимеразы I, а также гены устойчивости к антибиотикам тетрациклину и ампициллину с собственными промотор"
35 ными участками, обеспечивающие возможность двойного селективного контроля.
Способ конструирования рекомби" нантной ДНК рСЕК 10 заключается в том, что плазмидную ДНК pCEZ 12 обрабатывают последовательно эндонуклеазами рестрикции Е coRI, ДНК-полимеразой I Е.coli в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов для до- 45 стройки липких концов ДНК до тупых, и после удаления этих ферментов из смеси фенольной экстракцией, эндонуклеазой рестрикции PstI. Из полученной смеси выделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле и электроэлюции векторную часть плазмидной ДНК pCEZ 12 размером 3,50 т.п.о. Рекомбинантную плазмидную ДНК
pCI 55 обрабатывают последовательно эндонуклеазой рестрикции Bam HI, ДНК-55 полимеразой 1 Е.coli в присутствии дезоксирибонуклеотид трифосфатов, чем достигается достройка образовавшихся липких концов до тупых, и после удаления ферментов иэ смеси фенольной экстракцией, эндонуклеазой рестрикции PstI, и из полученной смеси вьделяют методом электрофореза и электроэлюции фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК pCI55 размером 3,71 т.п.о. Затем полученные векторную часть плазмидной ДНК pCEZ12 и фрагмент плазмидной ДНК рСЕ55 сшивают
ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии
АТР9 при этом ковалентная сшивка фрагмента и векторной части происходит по тупым концам ДНК с одной стороны и липким концам, образуемым рестрик" ционной эндонуклеазой PstI, с другой стороны, чем достигается направленная встройка фрагмента в векторную часть, обеспечивающая правильную ориентацию последовательности, кодирующей фрагмент ДНК-полимеразы I, относительно промоторно-операторной области Р /Р,„ и восстановление устойчивости к ампициллину, служащей селективным маркером при отборе целевой рекомбинантной ДНК рСЕК 10. Полученной смесью трансформируют СаС19-обработанные клетки и из клопов9 устойчивых к ампициллину и тетрациклину, вьделяют целевую рекомбинантную плазмиду рСЕК 1О.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 10 (фиг. 1). 10 мкг плазмидной ДНК
pCEZ 12 гидролизуют 20 ед, рестрикционной эндонуклеазы Е coRI в 10 мкл ( буфета для гидролиза, содержащего
20 мИ трис-HCl pH 7,8, 10 мМ MgCla9
50 мМ НаС1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, при 37 С 1 ч. В полученную рестрикционную смесь добавляют dATP, dGTR и TTP до 0,05 мИ каждого, 10 ед. ДНКполимеразы I и инкубируют 30 мин при 12 С. Реакцию останавливают добавлением Na<. ЭДТА до концентрации
20 мИ, белок удаляют экстракцией водным фенолом, рН 8,0, а ДНК трижды переосаждают 967.-ным этиловым спиртом из раствора 0,3 M ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат ДНК растворяют в 100 мкл буфера для гидролиза, содержащего 20 мИ трис-НС1 рН 7,8, 10 мИ MgC1<9 50 мИ NaC1, 2 мМ
2-меркаптоэтанола, .и гидролизуют
20 ед. рестрикционной эндонуклеазы
PstI при 37 С 1 ч. Реакцию останав!
392094 ливают добавлением Na> ЭДТА до концентрации 20 мМ, белок удаляют экст-. ракцией водным фенолом, рН 8,0, ДНК трижды переосаждают 96Х-ным этиловым спиртом из раствора 0,3 M ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат
ДНК растворяют в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС1 рН 7,8, 40 мМ Na> ЭДТА, 0,02Х. красителя бром-10 фенолового синего, и разделяют рестрикционные фрагменты ДНК электрофорезом в 4Х-ном полиакриламидном геле.
Гель окрашивают в растворе бромистого этидия 2 мкг/мл, вырезают из геля зо-15 ну, содержащую векторную часть ДНК плазмиды pCEZ 12, и выделяют ДНК из геля методом электроэлюции. 10 мкг плазмидной ДНК pCI55 гидролизуют
20 ед. рестрикционной эндонуклеазы
BamHI в 100 мкл буфера для гидролиза, содержащего 20 мМ трис-НС1 рН 7,8, 10 мМ MgC1, 50 мМ NaC1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, при 37 С 1 ч. В полученную реакционную смесь добавляют 25
dATP, dCTP, dGTP u TTP. до 0,05 мМ каждого, 10 ед. ДНК-полимеразы I u инкубируют 30 мин при 12 С. Реакцию останавливают добавлением Naz- ЭДТА до концентрации 20 мИ, белок удаляют экстракцией водным фенолом, рН 8,0 и ДНК трижды переосаждают 96Х-ным этиловым спиртом из раствора 0,3 M ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат ДНК растворяют в 100 мкл буфера для гидролиза, содержащего
20 мИ трис-НС1 рН 7,8, 10 мИ MgClq
50 мИ 1МаС1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, и гидролизуют 20 ед. рестрикционной эндонуклеазы Рз ? при 37 С 1 ч. Реак- 40 цию останавливают добавлением Nag »
«ЭДТА до концентрации 20 мМ, белок удаляют экстракцией водным фенолом, рН 8,0, ДНК трижды переосаждают
96 -ным этиловым спиртом из раствора 45
0,3 М ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат ДНК растворяют в
50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС1 рН 7,8, 40 мИ Naz. ЭДТА, 0,02Х красителя бромфенолового сине50
ro и разделяют рестрикционные фрагменты ДНК электрофорезом в 4Х-ном полиакриламидном геле. Гель окрашивают в растворе бромида этидия 2 мкг/
/мл, вырезают из геля зону, содержащую фрагмент ДНК плазмиды рСТ55, и выделяют ДНК из геля методом электроэлюции. 0,5 мкг полученного препарата векторной части ДНК-плазмиды,.
pCEZ12 и 0,5 мкг препарата фрагмента
ДНК плазмиды pCI55 растворяют в
30 мкл буфера для лигирования, содержащего 20 мМ трис-НС1 рН 7,5, 10 мИ
MgC1>, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и
0,5 мИ ATP и обрабатывают 2 ед.
ДНК-лигазы фага Т4 при 12 С в течение 12 ч. Полученную реакционную смесь используют для трансформации
СаС1 — обработанных клеток Е,coli которые затем высевают на 1,5Х агар
LB содержащий 20 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 30 С 16 ч. Из выросших индивидуальных колоний выделяют плазмидную ДНК известным методом.
Полученную целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рСЕК 10 анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции с последующим электрофорезом в 4Х вЂ” ном полиакриламидном геле (фиг. 2).
Пример 2. Использование рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 10 для создания штаммов E.coli — продуцентов фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.cali.
0,02 мкг рекомбинантной плазмидной
ДНК рСЕК 10. берут для трансформации
СаС1 — обработанных клеток Е.coli каждого из трех исследуемых штаммов
Y 1089, WR 3 110 и N 4830. Индивидуальные колонии каждого из штаммов, выросшие при 30 С на чашках с t,5X агаром LB, содержащим ампициллин—
50 мкг/мл и тетрациклин — 20 мкг/мп, пересевают и выращивают в 50 мл среды LB с антибиотиками ампициллином
50 мкг/мл и тетрациклином 20 мкг/мп до плотности 0,8-1,0 о.е./мл, затем растят еще 2 ч при 42 С. Клетки осаждают центрифугированием, промывают буфером, содержащим 50 мМ трисНС1 рН 7,5, замораживают в жидком азоте и хранят при -70 С.
Из 1 г биомассы клеток Е.coli каждого штамма выделяют фермент. Фермент характеризуют по ферментативной активности, гомогенность препарата доказывают анализом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
Данные по определению количественного содержания уерментативно активного фрагмента ДНК-полимеразы 1 в различных штаммах Е.cali приведены в таблице.
Из данных таблицы видно, что предлагаемая плазмида рСЕК 10 обеспечивает почти десятикратное по сравнению
1392094 6 т.п,о., уникальные сайты эндонуклеаэ рестрикции Pst I. Hind III — два сайта Xho I. Cla I, Bam I, Sal GI, генетические маркеры плазмиды: bla — ген, обеспечивающий синтез p — JlaI tet — ген,.обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, d polA — последовательность, кодирующую синтез фрагмента Кленова ДНК-полимераэь. I Е.coli сХ вЂ” ген репрессора фаг" М с1857, и промоторы Р1, „, Р, Р ь„, 2. Способ конструирования рекомбинантнои плазмиднои ДНК рСЕК 10, заключающийся в том, что рекомбинантную плазмидную ДНК pCEZ 12 обрабатывают последовательно эндонуклеазой рестрикции Е coRI ДНК-полимеразой I Е.coli и эндонуклеазой рестрикции PstI и из полученной смеси вь|деляют методами электрофореза и электроэлюции векторную часть плазмидной ДНК pCEZ 12 размером 3,50 т.п.о., рекомбинантную плазмидную ДНК рСХ 55 обрабатывают последовательно эндонуклеаэой рестрикции BamHI ДНК-полимераэой I E.coli и эндонуклеазой рестрикции PstI из полученной смеси выделяют фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК pCI 55 размером 3,71 т.II,î., затем векторную часть плазмидной ДНК РСЕК 12 и фрагмент плаз" мидной ДНК pCI 55 сшивают ДНК-лигазой фага 74 полученной смесью трансформируют клетки Е.coli и из клонов, устойчивых к ампициллину и тетрациклину„ выделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рСЕК 10. с прототипом pCI 55 увеличение выхода не отличающегося по удельной активности от прототипа активного фермен." та, при этом плазмида не требует специального штамма, содержащего профаг 5 (либо его фрагмент) >i c1857 ° Суммарное количество фермента в единицах активности. ИзобРетение позволяет получить штаммы-продуценты фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.col1, Уровень синтеза фермента в полученных штаммах Еосо13. 7 1089, MR 3110 и Б ч830, содержащих плазмиду рСЕК 10, не менее 375000-47/000 ед. сырого веса биомассы клеток, что в 7,5 — 9 раэ выше уровня синтеза этого фермента в сравнении с лучшими из известных штаммов— Е.coli N 4830, содержашим плазмиду pCI 55. Полученный положительный эффект изобретения достигается за счет свойств сконструированной новым способом плазмиды рСЕК 10, 25 Формул а и зоб ретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рСЕК 10, кодирующая синтез фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli c мол. мас. 4,75 м0 и размером 7,21 т.п.о., содержащая .Pstl-EcoRI — фрагмент плазмидной ДНК рСЕЕ 12 раэмерой 3, 50 т. п. о., Bam HI-PstI — фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК рС1 55 с последовательностью, которая кодирует фрагмент Кленова ДНКполимеразы I Е.coli, размером 3,71 Штамм Е.cali ферВыход фермента, е.а/r клеток, (Him) 10 * Плаэмида Пр едлагаемая 47,0 4,1 44„2+3,8 9,6+0,8 9 8+1,0 Y 1089 MR 3110 N 4830 N 4830 рСЕК 10 8,4+0, 7 37,"-+5 2 Прототип *Количествс фермента, очищенного по методу, изложенному в прототипе, выделенного из 1 г клеток. Суммарное количество фермента в единицах активности, 1392094 Eco Rf Hind III 1st ХМ/ Н/ cl tet со Ю/ Pst l (pal)j å@(peÖ H(nd tlul f/il7d /// дат У/ 1392094 Р 1/Л. 41 Составитель Т.Забойкина Редактор Н.Киштулинец Техред М.Дидык Корректор С,Шекмар Заказ 1868/30 Тираж 520 Подписное ВКИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035„ Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 УЬо/ Вот Н1(РЯ/ЕСоРЦаоЦ / Р/4 7У
