Способ получения поверхностного антигена гепатита в из плазмы крови человека

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБ ЛИК

ГОСУДАРСТВЕКХЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

„„SU „„1409121

t5g 4 А 61 В 10/00 А 61 К 39/00 (21) 3454639/28-14 (22) 09.06.82 (31) P-231588 (32) 10.06.8 1 (33) Р? (46) 07.07.88. Бюл. У 25 (71) Акадэмия Мздычна (PL) (72) Витольд Бжоско, Петр Яниски, Збигнев Кпасковски, Казимеж Мадалиньски и Анджей Донброва (PL) (53) 615.373 (088,8) (56) Eveline Е. Reerink et al. Viral ,Hepatitis Jut. Symposium, edt. by

Franklin Just. Ress., Sect V,1981, 437-450. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IIOBEPXHOCT—

НОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ИЗ ПЛАЗМЫ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, включающий делипндизацию и предварительное удаление белков плазмы путем обработки полиэти-f ленгликолем, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения чистоты конечного продукта, после делипидизации и предварительного удаления белков плазмы,исходный продукт обрабатывают пепсином в количестве

0,01-0,5 мг/мг белка, далее фильтруют на молекулярном фильтре, позволяющем прохождение частиц до 100000 дальтон в фосфатно-буферной среде при рН 7,1 7,3, и деэактивируют формальдегидом в количестве l:2000 объем/ объем в течение 96 ч.

140912 1

Изобретение относится к получению чистого поверхностного анти гена гепатита В (HBsAg) из плазмы крови чело-. века и может быть использовано для получения HBS-антител при лечении.

Целью изобретения яв..яется повышение чистоты конечного продукта.

Способ осуществляется следующим образом. 10

На первой стадии проводят делипидизацию плазмы крови человека. Для этого к 1000 мп плазмы, полученной от доноров HBsAg, имеющей титр согласно определению методом иммуно- 15 электроосмоосаждения (IEOP) минимально 1:10, прибавляют 100 мл 0,1 моль

М С1 4H О.

После прибавления хлористого мар" ганца плазму перемешивают в электро- 20 магнитном смесительном устройстве при температуре ледяной бани в течение I ч. Затем материал центрифугируют в течение 30 мин при скорости 6000 1/мин. После центрифугирова- 25 ния отбрасывают осадок, не содер— жащий HBsAg. Слой жидкости, полученный в результате центрифугирования, доводят до рН 5,6, применяя

О,lн.HCI, и прибавляют полиэтилен- 30 гликоль 6000 (PEG 6000) в количестве 75 г на 1000 мп материала. Затем материал перемешивают в течение 12 ч при 4 С в электромагнитном перемео шивающем устройстве. Материал выгружают,из смесителя и центрифугируют

30 мин при скорости 6000 1/мин.Слой жидкости, не содержащий антигенов, отбрасывают и для последующей обработки собирают осадок, полученный в 40 результате центрифугирования.

Этот осадок растворяют в 200 мл

0,9 М NaC1 и раствор разбавляют деионизировапной водой до объема, который ранен Объему материала перед 45 центрифугированием. После прибавления NaC1 осадок переходит снова н раствор. Этот раствор еще раэ поднергают центрифугиронанию 30 мин со скоростью 600 1/мин. После центрифу50 гирования слой жидкости, содержащий

HBs антиген, собирают, остаток, не содержащий его, отбрасывают. Прибанлением деионизированной воды объем слоя жидкости доводят до

10 000 мп. Небольшое количестно

55 остатка, оставшегося после разбавления, удаляют центрифугированием в течение 30 мин при скорости 6000

1/мин. На последующей стадии процесса получения антигена применяют слой жидкости, получившийся в результате этого центрифугирования.

Материал, полученный в ходе делипидизации, подвергают перевариванию с ферментом. Для этого 1000 мл материала нагревают до температуры окоо ло 37 С устанавливают прибавлением

lн. HCI pH 2,5. К полученному таким образом материалу прибавляют пепсин

li н сигма, несколько раэ кристаллиэуют в количестве около 0,05 мг на 1 мг белкового раствора. Содержание белков в растворе определяют спектрофотометрическим методом. Через 1 ч переваривания с пепсином его прерывают пут и установления рН раствора 4,6 дейстнием Iн. Na0H. После завершения переваривания раствор центрифугируют

30 мин со скоростью 6000 1/мин. В осадке; образовавшемся после центрифугирования, HBsAg не обнаруживается, поскольку он полностью переходит в слой жидкости.

Переваривание с пепсином вызывает расщепление белков плазмы человеческой крови до полипептидных единиц, размер которых не превышает 30000 дальтон. Однако белок HBsAg не подвергается перевариванию.

Затем следует стадия очистки материала от белков плазмы, переваренных с пепсином, при помощи молекулярной фильтрации на фильтрах, пропускающих частицы величиною до 100000 дальтон. Для этого может применяться система фильтров с замкнутым циклом производства Amicon Company (CIIIA), в которой материал, подлежащий фильт-. рации, многократно фильтруют через зону фильтрации,где частицы отделяются от раствора при помощи молекулярных фильтров с размером, меньше, чем предел фильтрации. Согласно предлагаемому способу применяют фильтрацию через фильтры типа Н1 «! 00, позволяющие проход частиц величиною до

100000 дальтон. Полный цикл фильтрации заключается в 9-кратном прокачинании материала в объеме 80 л при давлении 0,63 атм. Материал перед подачей в фильтрующую систему разбавляют до указанного объема фосфатным буфером на основе деиониэированной не вызывающей лихорадки воды с рН 7,1 — 7,3. Такая вода может быть

3 14091 получена на аппаратуре, выпускаемой фирмой EIGA Company (Великобритания) .

В ходе фильтрации происходит пол— ное вымывание белков ппазмы, которые бьити предварительно переварены с пепсином. Материал, полученный из фильт— рационной система, содержащий очищенный HBsAg, помещают порциями по

10000 мл в холодильник на 96 ч, прибавив формальдегид в количестве, необходчмом для создания его концентрации в растворе 1:2000 по объему.

После того, как раствор вынут из холодильника, формальдегид удаляют из материала при помощи дедиалиэации.

Затем проводят адсорбцию HBsAg на гидроокиси алюминия, прибавляемой в количестве 1 мг на 1 мп раствора.

Готовый продукт, полученный таким об- 20 разом, помещают в ампулы.

Затем анализируют его на присутствие в нем белков плазмы крови человека методом двойной диффузии в агаре, при этом не обнаруживается линий 25 осаждения при 30-кратном разбавлении плазмой антипротеинов человека. Он также не содержит инфекционных частиц вируса гепатита В.

Пример 1. От донора HBsAg плазму собирают при помощи плазмофореза. Активность HBsAg определяют методом иммуноэлектроосмофореза с титром, не ниже чем 1:16. Плазму крови человека подвергают процессу делипидизации путем прибавления, в расчете на I л плазмы 1 л l М MnCl х к4Н О и 150000 международных единиц гепарина в объеме 30 мл. Этот материал инкубируют при комнатной температуре в электромагнитном перемешивающем устройстве в течение 30 мин.

По истечении этого времени весь материал центрифугируют на центрифуге типа Бекман S-6 с мотором SA-10 при 45 скорости 6000 l/ìèí в течение 30 мин.

Полученный остаток, представляющий собой HBsAg (-), отбрасывают, слой жидкости собирают в колбу вместимостью 2 л.

К продукту прибавляют то же количество 7,51-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000.

Устанавливают рН среды равным 5,5 при помощи lн.НС1. Продукт помещают

55 в холодильник и инкубируют ночь при постоянном перемешивании.

На следующий день центрифугируют на центрифуге Бехман J=6 с мотором

2!

JA-100 при 600 1/мин. Слой жидкости, являющийся НВзАд, (-), отбрасывают, остаток растворяют в 200 мл 0,97-но-го NaC1 и разбавляют деионизированной водой до объема 2 л. Через

20 — 30 мин обильный осадок удаляют центрифугированием в течение 30 мин на центрифуге Бекман J-6 с мотором

JA-10 при скорости 6000 !/мин.

Полученный прозрачный фильтрат имеет активность HBsAg согласно определению методом иммуноэлектро— осмофореэа с титром 1:8. Объем раст— вора увеличивают до 10 л раэбавлением деионизированной воды (2 л +

+ 8 л деионизационной воды). Через

30 мин наблюдается небольшое количество осадка, который удаляют центрифугированием на центрифуге Бекман

J-6 с мотором JA-10 при скорости

6000 1/мин в течение 30 мин. Получают прозрачный слой жидкости с титром около 1:2 согласно тесту на иммуноэлектроосмоосаждение.

К 10 л жидкости прибавляют 90 г

NaC1, получая 0,97.— ный раствор NaC1.

Продукт, полученный таким образом, инкубируют при 37 С в течение 12 ч. о

По истечении этого времени к жидкости при 37 С и при рН 2,5 прибавляют пепсин в количестве 0,01 мг на 1 мг белков. Переваривание пепсина с про— о дуктом производят 1 ч при 37 С. Через

1 ч переваривание прекращают путем прибавления О, l н. NaOH до установления рН до 3,5.

Оставг ийся осадок центрифугируют в течение 20 мин на центрифуге Бекман .1-6 с мотором JA-10 при 6000 1/ìèí и затем осадок отбрасывают.

Слой жидкости подвергают молекулярной фильтрации в аппарате ДС 30

Amicon Company с применением полого волокнистого фильтра Н 10 100. Фильтрацию ведут в среде фосфатного буфера с рН 7,1.

Получают в результате молекулярной фильтрации материал объемом

10 л, титр при определен»и методом иммуноэлектроосмоосаждения HBsAg 1:2 °

Этот материал при 100-кратном раэбавлении не показывает линий осаждения по технологии иммунодиффузии с применением плазмы крови животных антиIgG, анти-IgM, анти-IgA, анти-протеиНоВ человека и плазмы антипротеинов человека. Антиген, очищенный от про1»0 !

Химические характеристики вакцины для вирусного гепатита В:

HBsAg мм/см. 0,5

Общий б елок, „/смЗ 0 5

Полипептиды, мм/см 0,02

Молекулярный вес 30000

NaC1, 0,85

25

Составитель Г.Жукова

Редактор О. 10рковецкая Техред М.Ходанич Корректор И.Муска

Заказ 3362/58 Тираж 655 Подписное

Бг!!1!П!Ч Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская ваб., д. 4/5!!Роизвс дствс в»о-»nëèãðàôè÷åñêoå предприя гие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 »ов и»аз я,инактивирован формальдеt ядом в гечение 96 ч в количестве

i:2000 по объему.

Вакцинация лабораторных животных, 5 таких как морские свинки или кролики, с 100--кратным разбавлением материала не дает нммуногенной реакции против заражения препарата белком, происходящим из плазмы крови человека. Полу- 10 чается только одна линия осаждения с материалом, содержащим HBsAg.

Материал, полученный предлагаемым способом, является сильно иммуногенным, что доказано при вакцинации шим — 15 панзе и 10 человек.

21 ь

1 идроокись алюминия, мг/см 1

Мертиолат, мм/ см 100

В материале не присутствует

HBsAg, HBsAg u DNA полимераэа, что доказано с применением третьего псков ления тестов.

Пример 2. Исходный материал обрабатывают по способу примера 1, используя для разложения белков большее количество пепсина, т.е. 0,5 мг пепсина на 1 мг белков при 37 С.

Далее полученный продукт фильтруют на молекулярном фильтре, как в примере

1, при этом используют фосфатно-буферную среду с рН 7,3 и дезактивируют формальдегидом в количестве 1:2000 по объему в течение 96 ч. Необходимую концентрацию формальдегида получают добавлением 150 см 4 -ного раствора формалина к 10 дм фильтрата.

Предложенный способ позволяет по— высить чистоту HBsAg до 100 (по известному 15Z) .