Способ получения гидрокортизона

 

Изобретение относится к микробиологической промьгашенности и может быть использовано для получения стероидных гормонов. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Сущность способа сводится к тому, что осуществляют трансформацию вещества S Рейхштейна с использованием культуры Curvularia lunata. Для этого мицелий и трансформируемый субстрат в кристаллической форме инкубируют в буферной среде при в течение 48-168 ч, при этом соотношение сухото мицелия и вещества S Рейхштейна в среде составляет 1:0,2-1, т.е. на 10 г/л сухого мицелия - 2-10 г/л субстрата . Выход целевого продукта 55- 72,4%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А1 (51) 4 С 12 Р 33/ОО

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

БЕРЛМОТ : 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4060091/23-13 (22) 21. 04 . 86 (46) 23.07.88. Бюл..И 27 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (72) Г.В.Суходольская (SV) Б.А.Ангелова (BU), К,А,Кощеенко, И.М.Басовская и Г.К.Скрябин (SV) (53) 615.361,34(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 555115, кл. С 07 С 167/08, 1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОКОГТИЗОНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения стероидных гормонов. Цель изобретения— повышение выхода целевого продукта °

Сущность способа сводится к тому, что осуществляют трансформацию вещества "S" Рейхштейна с использованием культуры Curvularia lunata. Для этого мицелий и трансформируемый субстрат в кристаллической форме инкубируют в буферной среде при 28 С в течение

48-168 ч, при этом соотношение сухо го мицелия и вещества "S" Рейхштейна в среде составляет 1:0,2-1, т.е. на

10 г/л сухого мицелия — 2-10 г/л субстрата. Выход целевого продукта 5572,47.

1411336

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения стероидных гормонов, а именно гидрокортизона. 5

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Пример 1. Культуру C rvularia

lunata ВКМ F-644 хранят в пробирках

:на скошенной агаризованной среде сле- 1р ующего состава, г/л:

Дрожжевой экстракт 4,0

Солодовый экстракт 10,0

Глюкоза 4,0

Агар 30,0 t5

Вода дистиллированная

Среду с рН 6,2-6,9 стерилизуют при 1 атм 30 мин. При пересеве гриб выра цивают в течение 4 сут при 28 С. Срок, хранения культуры - не более месяца. 2р

Споры гриба смывают с поверхности arapa стерильной водой, либо средой вносят в колбы Зрленмейера объемом

750 мп с 50 мл среды следующего сос тава, r /л . 25

Сахароза

Дрожжевой автолизат

НаИО (ИН ) НРО

К НЩ

КС1

NgSO4 7Н20

Вода дистиллированная, рН среды 6,0-о 1

30,0

2,5

2,0

3,0

1,0

0,5

0 5

Среду стерилизуют. при 1 атм 30 ьин, Культуру выращивают в течение 48"60 ч (о при 28 С и 220 об. /мин. Полученным инокулятом в объеме 10 мп засевают такие же колбы с 50 мл среды и выращи- 4р вают культуру в укаэанных условиях.

Затем мицелий отфильтровывают, отмывают от питательной среды буфером (0,05 М К ЧРΠ— NaOH, рН 6,0) и используют для проведения процесса 45 трансформации.

Реакцию трансформации проводят в 50 мп 0,05 М КН PO — NaOH-буфера, рН 6,0, куда вносят 5 г отмытого мицелия (О 5 r по сухому весу) и 0 1 г вещества "S" Рейхштейна в кристаллической форме (2 г/л), соотношение мицелия (в расчете на сухой вес) и вещества "S" равно 1:0,2.

Реакционную смесь инкубируют при о

28 С в условиях перемешивания и аэрации в течение 48-168 ч. Затем из целой реакционной смеси вьщеляют гидрокортизон экстракцией хлороформом. Выход целевого продукта в лабораторных условиях равен 72,47, содержание остальных стероидов: 14о.-оксипроизводные вещества "S" Рейхштейна 57; 6/, 11at-оксипроизводные вещества "S" 57..

Пример 2. Выращивание мицелия гриба Curvularia lunata ВКМ F-644 (инокулята), условия иммобилизации инокулята в Са-альгинатный гель, выращивание мицелия в гранулах Са-альгинатного геля описаны в примере 1.

Кристаллический субстрат — вещество "S" Рейхштейна, вносят в среду для трансформации в концентрации 10 г/л, т.е. 500 мг кристаллического субстрата вносят в 50 мл 0,05 М КН РΠ—

NaOH-буфера, рН 6,5, содержащего 0,5 г мицелия (сухой вес) (соотношение 1:1).

Выход гидрокортизона при трансформации вещества "S" Рейхштейна в концентрации 10 г/л после 7 сут инкубации составляет 55-60, т.е. 5,5—

6,0 г/л. Содержание остальных стероидов; 14о(-оксипроизводные вещества "S"

Рейхштейна 15-207 суммарное содержание других побочных продуктов 8-10 .

Для осуществления способа можно испольэовать иммобилизованный мицелий.

Пример 3. Культуру С. lunata

ВКМ F-644 (инокулят) выращивают, как описано в примере 1.

Полученный инокулят в объеме 10 мп иммобилизуют в Са-альгинатный гель.

С этой целью к 7 мп 6%-ного гомогенного раствора Na-альгината добавляют

3 мл 0,97-ного раствора хлористого натрия и 10 мп культуральной жидкости °

Тщательно перемешивают и при помощи шприца или перистальтического насоса по каплям при перемешивании вносят в 17-ный раствор хлористого кальция.

Образующиеся гранулы Са-альгинатного геля (cj=2-3 мм), содержащие мицелий, выдерживают в 1 -ном растворе хлористого кальция в течение 2 ч, отмы" вают 0,05 М КН PO - NaOH-буфером, рН 6,0, и вносят в колбы с 50 мл ростовой среды. Для сохранения гранул в среду добавляют 1 мл 17. †но раствора СаС1 . Выращивание иммобилизой ванного инокулята проводят в условиях„ аналогичных условиям выращивания свободного мицелия. После 48-60 ч роста гранулы геля отделяют от среды, промывают буфером и используют для трансфор ма ции .

1411336 на 10-15Х, суммарное содержание других побочных соединений 5Х.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить выход целевого продукта, упростить его и повысить концентрацию трансформируемого субстрата.

Формула и зобр етения

Составитель С.Листвинова

Редактор Н.Яцола Техред М.Ходанич Корректор Л.Патай

Заказ 3621/24

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

3М

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Трансформацию вещества "S" Рейхштейна в концентрации 2 г/л проводят при 28 С и 220 об./мин.

В колбы Эрленмейера объемом

750 мп с 50 мл 0,05 М КН РО - NaOHбуфера, рН 6,0, вносят 16,5 г гранул (сырой вес), содержащих 5 r иммобилизованного мицелия и 100 мг кристаллического субстрата. 10

В процессе трансформации из реакционной среды отбирают аликвоты и проводят анализ образуюпдхся стероиднык соединений методом ТСХ. Промьггые гранулы используют для проведения по-15 следующей трансформации.

Максимальное количество гидрокортизона накапливается в среде за 48 ч инкубации субстрата с иммобилизованным мицелием. Выход гидрокорти зона 20 составляет 60-65 или 1,2-1,3 г/л.

Содержание других стероидов: 144-оксипроизводное вещество "S" РейхштейСпособ получения гидрокортизона, включающий трансформацию вещества

"S" Рейхштейна с помощью мицелия гриба Curvularia lunata с последующей экстракцией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, вещество "S" Рейхштейна используют в кристаллическом виде при соотношении сухого мицелия и вещества "S" Рейхштейна в реакционной среде 1:0,2-1, а экстракции подвергают реакционную среду с мицелием.