Штамм гриба claviceps purpurea-продуцент пептидных эргоалкалоидов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИК

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 1 с ..

I.÷:..

° 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

t (46) 23.02.90. Бюл. N 7 (21) 3841889/28-13 (22). !0.01.85 (7I) Всесоюзный научно-исследовательский институт лекарственных растений (72) М.А.Саркисова (53) 547.94 (088.8) (56) Патент СССР II 562205,. кл. С 12 P 33/20, опублик.1973. (54) ШТАММ ГРИБА CLAVICEPS P0RPUREAПРОДУЦЕНТ ПЕПТКДНЫХ ЭРГОАЛКАЛОИДОВ (57) Целью изобретения является получение штамма гриба Clav !ceps purpu rea ВНИИА .11 312-А, обладающего стабильно высокой продуктивностью.

Штамм получен путем облучения УФ-лучами суспензии спор спорыньи со ржи с последующей селекцией на питательных средах. При выращивании на агаризованных средах через 5-6 дней образуются колонии вначале светлые, (5I)5 С 12 М I/14 С 12 P 33/20 впоследствии приобретают буро-ко.ричневую окраску. 2-3-недельная колония имеет рельеф конуса, края колонии четко ограничены. Штамм растет в виде мицелиальных клеток сильно гранулированных, диаметр которых

30-50 мкм. Конидий не образует.

Штамм культивируют в условиях погруженной культуры в жидких средах, содержащих различные сахара, органи-.. ческие кислоты, источник азота.и минеральные соли, рН .среды 5,0-5,5.

Период культивирования от 4 до 20 дней. Культивирование можно прово" дить одно, двух- и трехступенчато.

Наиболее благоприятным является использование соотношения инокулюма и среды от I 5 до I 20. Средняя продуктивность штамма на 8-,10- H ll-й день культивирования составляет

1275, 1572 и 1760 2|/ìë, максимальная продуктивность 1657, 1701 н

2315 )/мл соответственно.

1 (((7 20

Изобретение ОтносиT H !(MHI(I!обиаЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И ПРЕДСТЯВ" ляет cобай 17Iтамм спорыньи, продgцирующий фармаколагически ценнь(е пеп-тидные эргоалкалоиды В сяпрафитных

1IpH глубинной ферментации.

Целью изобретения является штамм

61ач 1серз pu rpurea, Обладающий Высо = кой продуктивностью. 7!I .. Штамм гриба C1aviceps purpu< =a

1"Аi получен путем сблучения,уф-=лучами суспензии спор спорыньи са ржи с последующей селекцией ня ягариэаваиных питательны71 средах„

111ТЯМИ Грнба C 1 aV j СЕ pc pu(-рп Гл

К-41 депонирован в коллекции -ь- тур микроорганизмов В(.е(аюзног ;" научна исследовательского институ та антибиотиков H имеет регистраци- 2О Онный номер 312-А.

Штамм Clavfceps purpureа ВНИИА

Р 312-А характеризуется следующими

rIpMSHaKaMEå

Иорфолаго-культуряльнььэ признаки., При Выращивании на агяризовяннай ср-„- де Т2 (состав средь:, в г/л,",. caxapasa 100, дрожжевой экстракт 0,1,.

Яспарагии 10, KH„P0 0,25,. КС1 0,(.2...

NgS0 7Н 0 0,25, CaNO 1, Ге50 7 ., 0,02, ZI>SO 7Н О 0.015„ агар 20, : Дистиллированная aopa - 1000 см -, рН 5,2) заметный рост штамма прояв= .ляется на 5-6 сутки. Образующиеся колонии вначале светлъ1е, прозрачные,, впоследствии приобретают буро -карич--.

Невую окраску, 2-3-нецельные кало-НИЦ ИМЕЮТ СКЛЯДЧЯ гУЮ КРУЛЧ 1ЧЯТУЮ,, Я. суа край четка Ограничены„вепьеф ка*-нуся иногдя ус еч еяп(, го,,;,-;",;: цу 40 выращивания размер калан: : О(0,8 с:.. дб 1,5 см, цвст (3gpo- KGp_#_lч!IBB!cМ: обратная сторона колавий беже77ага цветя, П1тямм рястет р Виде мицели аль нь|х клетОк акрчглых дна74етром 30 " 4

50 мкм,, cHJlbHG гранулираванных. ЬОиндий В укаэанных условиях не образует.колонии эчого штамма легко от-= деляются от агаровой cpeД!ы и Dprl пе=:

7 реносе в жидкую среду распадаются нв:.:„.>

Отдельные клетки или небольшие Ягаегаты их.При рос,е в жидких средах штамм выделяют в среду пигмен-, среда Окрашивается в бурый и (.Ветло-,коричневый цвет,;, иногда по1ти да черного.

Физиологические признаки. Штям-::.. культивируют в аэробных условиях TI пОгруженнай кульTvpe в жид" :(х сре" дах, содержащих в качестве источника углерода преимущественно сахаро"="ó., глюкозу, (винит, глицерин, орган-, ьческие кислоты — лимонную или ян-.àðíóþ кислоту. В качестве источни". (.а азота мажет быль аммиак, аспараин, дрожжевой экс (ракт или аммонийная соль. Б качестве минеральных со" лей маг7JT быть использованы KJIopH

JIbI, нитраты, фосфаты, соли магния, железа H цинка е

Штамм Отличается стабильной xopoIIIo Воспроизводимой продуктивностью и b(or!(BT быть сохра:eH путel-; культивирования на средах или глубоким заморяживянием В жидком язате.

КульT "p . Вь(ращивяют ня чяшкях

17етри или В колба".I HR качЯлках са скоростью ВРащен я i 80 240 Об/мин при 20-30 ., период культивирования ат 4 да 20 дней. ETamI выращ(шают на средах при рН 5,.0-5,5.-В.период,интенсиннога синтеза алкалоидой рН среды колеблется от 3,12 до 6,2 в

=aIIècèèGcTH оТ составя испОльзован нь(х сред, Культивирование можно про-, водить одна, двух- и трехступенча .-.G. Наибслее благапри."..Тным являет"я использование cGGTHor!IBHHJI инакулюма H cpepb! GT iI5 да 1 20„

11 р и м e p 1 а Ш 1амм риба C18

4 1(eps рцгри геа ВНИИА Ny 31 2-А Выращивают в течение (3 дней на агариза= ванной питательной среде Т2, Затеи колонии I амат ениэируют и переиОсят в колбы Эрленмейера объемом 500 см

Одержащих 50 cN . " ьной срдь1

Tg следующего состава, г/л: глюкоза

;00, лимонная кислота i0 КН<РО

0,5, NgSA< 7HÄO 0,3, дрожжевой кстракт O,i, ГЯSO, 7НрО 0,007, :nS0< 7Н 0 0,006 дистиллироваиьая з ваца 1000 см ., рН до 5,2 аммиаком, Культуру выра(1ивакт на качалках о

В темноте при темпеаятуре 24 С в те.(ение 6 дней,: 5 мл полученной культу" ры инакулируют и колбы такого же объема с 50 см среды Т25 следующего состава„ r/JI; сахароза 30

71 коннай кислота 15, КН РО„ 0,5,Д . 1дЫ 1 7Н, 0 0,25, дрожжевой экствак1" О; 1 Y» I 0 i 2 FBSO4 7Н О

0 007 2I (SO 7Н 0 0 006 дисткплираванная Вода - 1000 см, рН— да 5,2.аммиакам. Культивирование

ПРОВОДЯ1 В т(ъЧЕНИЕ О Дней, Содержание суммы пептидных за1Оглкалаидов В миц лии и культуряль

1342011 ной жидкости определяют по методу

Румпеля.

Для определения алкалоидов культуральную жидкость отделяют от мицелиальной массы фильтрованием. Культуральную жидкость отделяют, измеряют объем, а мицелий двалщы промывают дистиллированной водой по 10 мл.

0,3 г сырого отфильтрованного мицелия растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством песка и добавляют 2 мл 4Х-ного раствора винной кислоты в 507 метаноле. Полученную массу переносят в коническую центрифужную пробирку. Экстракцию проводят на водяной бане при температуре

50-60 С в течение 3 мин при перемешивании. К горячему виннокислотному извлечению добавляют 2 мл 107.-ный раствор уксуснокислого цинка перемешивают и отстаивают в течение

l0 мин, Затем центрифугируют нри

2000 об/мин в течение 10 мин. К

1 мл йрлученной надосадочной жидкосI ти добавляют 2 мл реактива Ван-Урка (раствор парадиметиламинобензальдегида в 607.-ного растворе серной кислоты) и оставляют на свету. Через

30 мин растворы, окрашенные в синефиолетовый цвет, колориметрируют на ФЭК-И с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание алкалоидов рассчитывают по калибровоч— ной кривой, построенной по эргота" мину-тартрату. Содержание алкалоидов в процентах (Х) рассчитывают по формуле: а.4.100.100

Х = --À -А- ---(---- --»Ф

0,3. (100-Ь} где а — количество эргоалкалоидов в 1 мл раствора, r найденное по калибровочному графикуg

- влага, 7.

Для определения содержания эргоалкалоидов в культуральной жидкости (КЖ) к 2 мл КЖ добавляют 4 мл реактива Ван-урка, перемешивают, оставляют Ha свету и через 20 мин ... колорнметрируют на ФЭК. Количество .эргоалкалоидов (Х) в КЖ рассчитывают по формуле

Х = а.1000 100 мг 7., где

Таким образом, проведенная проверка показала, что штамм Claviceps

purpirea ВНИИА Р 312-А продуцирует пептидные эргоалкалоиды, при этом продуктивность его в процессе ферментации составляет на 8 сутки культивированияия 1 б 57 g /мл, 40 Пример 2. Культуру выращивают на агаризованной среде Т2 .и в среде Tg аналогично примеру 1.

5 мл инокульной массы засевают кол- бы 50 см среды 668 следующего сос».

45 тава, г/л: сахароза 60, глицерин 60, глюкоза 80, дрожжевой экстракт 0,1, лимонная кислота 15, КС! 0,125, КН РО 0,5, HgSO< 7Н О 0,5,Ге50,х х7Н,О 0,007, ZnSO 7Н 0 0,006, дис

5 тиллнров анна я в ода — I 000 см, рН до 5,2 аммиаком. Через 10 дней вы. ращивания штамм продуцирует 1701 " /

/мл сумМы эргоалкалоидов.

Пример 3. Колонии с агаризо ванной среды Т2, выращенные 21 день, гомогенизируют, засевают колбы Эрленмейера с 50 см среды Tg и выращивают в тех же условиях, что и в а — колич ес та о э р г оалк алоидов в 1 мл КЖ, r, найденное по калибровочному. г рафику.

Общую алкалоидную продуктивность

5 подсчитывают как сумму алкалоидов, найденных в КЖ и мицелии. Для идентификации алкалоидов проводят вы-.деление суммы алкалоидов из KR u

10 мицелия. КЖ и мицелий подщелачивают до рН 9-10, экстрагируют хлористым метиленом, затем 27.-ным водным раствором кислоты. Виннокислотное извле» чение подщелачнвают до рН 9 и вновь экстрагируют хлористым метиленом.

Хлористометиленовый экстракт сгущают. и добавляют гексан для осаждения алкалоидов. Полученную порошкообразную сумму алкалоидов сушат

20 в вакууме.. Пептидные эргоалкалоиды в выделенной сумме подтверждают ме" .тодами тонкослойной хроматографии с разными сорбентами в разных системах, растворителей в сравнении с досто25 верными образцами эргоалкалоидов пептидного типа (группы эрготамина и эрготоксина), методом жидкостной хроматографии и установлением амннокислотного состава пептидной части

30.молекулы после кислотного гидролиза.

Составитель В. Романова

Редактор Л.Павлова Техред Л. Сердюкова, Корректор Л.Пилипенко

Заказ 502 Тираж 487 Подписное

ВНИ1ЙИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãoðoä, ул. Проектная, 4

13420»

6 примере 2. 5 мл инокульной массы за= Ф о р и у л а н з о б р е т е н и я севаот колбы с 50 см среды 668.

Через ll дней культивирования штамм Штамм гриба Clavtceps purpurea продуцирует 2315 f/ìë суммы зргоал- ВНИИА У 312-A ..- -продуцеит пептиднык Б калоидов, эргоалкалоидов .