N-нитрозо-n-(бэта-хлорэтил)-карбамоилпептиды или их хлоргидраты,обладающие противоопухолевой активностью
Изобретение касается замещенных пептидов, в частности М-нитрозо-Н-(Й- -хлорэтил)карбамоилпептидов общей формулы rClCHjCH2-N(NO)-C(0)NH}nR, где п 1 и R-Lys-Prc-Val-NH , Trp-Leu-u( -Asp-Phe-NHj , Pro-Val-NH , Gly-Lys-Pro-Val-NHj, Trp-Gly-Lys-Pro- -Val-NH ; n 2, R Lys-Pro-Val-NHj, или их хлоргидратов, обладающих противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных пептидов . Их синтез ведут обработкой соответствующего ацетата В-хлорзтилизоцианатом в присутствии триэтиламина в среде диметилформамида. Новые вещества обладают лучшей активностью в отношении лейкомии L 1210, амеланотических меланом, легочных опухолей, чем известные цитостатические агенты - хлорозотицин или BCNY. 9 табл. « сл
СОЮЗ С08ЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3605466/23-04 (62) 3506053/23-04 (22) 20,06.83 (23) 15.11.82 (31) 3073/81 (32) 22.10,81 (33) HU (46) 07.08.88. Бюл, N 29 (71) Хиноин Дьедьсер еш Ведьесети
Термекек Дьяра PT (HU) (72) Хелга Шюли, Кальман Медзихрадски, Хедвиг Медзихрадски, Карой Лапиш, Ласло Коппер и Андраш Йенеи (HU) (53) 547 ° 964.4.07(088. 8) (56) Jonston Т.P. и др. J. Med.chem, 1963, 6, 669. (54) N-НИТРОЗО-N- (БЭТА-ХЛОРЭТИЛ) КАРБАМОИЛПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ ХЛОРГИДРАТЫ, ОБЛАДАКМЦИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение касается замещенных
„„Я0„„1414851 д 1 (51)4С 07 К5 10 А61 К37 02 пептидов, в частности N-нитрозо-N-(8-хлор этил) карбамоилпептидов о бщей формулы jClCH СН -N(NO) C(0)NH „R, где n = 1 и R — 1,уз-Pro-Val-NH
2>
Trp-Leu-ol-Asp-Phe-МН2, Pro-Val-ИН
Gly-Lys-Pro-Val-NH,, Trp-Gly-Lys-РгоЧа1 БНт n = 2 R Lys Pro Val ИН или их хлоргидратов, обладающих противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель— создание новых более активных пептидов. Их синтез ведут обработкой соответствующего ацетата Й-хлорэтилизоцианатом в присутствии триэтиламина в среде диметилформамида, Новые вещества обладают лучшей активностью в отношении лейкомии L 1210, амеланотических меланом, легочных опухолей, чем известные цитостатические агенты — хлорозотицин или BCNY. 9 табл.
1414851
Изобретение относится к новым биологически активным соединениям N-нитрозо-N-(бэта-хлорэтил) карбамоилпептидам или их хлоргидратам, обладающим противоопухолевой активностью, кото5 рые могут найти применение в медицине.
Цель изобретения — поиск новых производных пептидной структуры,об-. ладающих более высокой противоопухолевой активностью, Пример 1. Альфа, эпсилон: -бис-(бэта-хлорэтилкарбамоил)лизил пролилвалинамид. 15
736 r (1, б ммоль) лизилпролилвалинамиддиацетата растворяют в 8 мл .диметилформамида и раствор охлаждают о до О С. Далее в раствор по каплям : добавляют 0,46 мл (3,2 ммоль) триэтил-20, :амина и 0 34 мл (4 ммоль) бета-хлор, :этилизоцианата. Реакционную смесь ,перемешивают при О С в течение 4 ч, после чего ему дают постоять и перегоняют в вакууме, Остаток смешива- 25 ют с водой, выпавший в осадбк продукт отделяют фильтрованием и сушат, Таким образом получают 480 мг указанного соединения. Выход 54%; т. пл.
183-1850С; R f = 0,75 (смесь н-бута- ЗО иола с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 4;I!1:
:1; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Кизельгеля G).
Вычислено, %! С 47„82; Н 7,11;
N 17,74; Cl 12,83, С Н уИ О С1 (552в5).
Найдено, %; С 47,90; H 7,60;
N 17,41; Cl 13,26.
R g = 0,82 (этилацетат, пиридин„ ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:20:б:11); В.г = 0,72 (бутанол, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4 .1:1) .
Пример 2. Альфа, эпсилон-бис-(И-нитрозо-М-(бета-хлорэтил).-, карбамоил)лизилпролилвалинамид, 460 мг (1 ммоль) лизилпролилвалинамиддиацетата растворяют в б мп диметилформамида, после чего в приго- 0 товленный раствор добавляют 0,28 мл (2 ммоль) триэтиламина,и 548 мг. (2 ммоль) И-нитрозо-бета-хпорэтилкарбамоил-и нитрофенола, а затем
270 мг (2 ммоль) 1-оксибензотриазола. По истечении 2 ч диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток растворяют в 30 мп этилацетата и экстрагируют водой.. Этилацетатную фазу сушат, упаривают. Остаток обрабатывают безводным диэтиловым эфиром, затем диэтиловый эфир декантируют и масло высушивают. Полученную таким образом твердую пену чистят в колонке, заполненной силикагелем. Фракции собирают и растворитель отгоняют в вакууме.
Остаток растирают в порошок в присутствии безводного петролейного эфира и отфильтровывают. Таким образом получают 312 мг указанного соединения, Выход 517.
Rg указанного соединения 0,80 (смесь метанола с этилацетатом в соотношении 1:3; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Кизельгеля С), R = 0,79 (бутанол, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4:1:1).
Rg исходного продукта 0,88 (смесь этилацетата с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении
240;20:6:11; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием
Кизельгеля G).
f = 185 (iV-нитрозогруппа, 397 нм).
Вычислено, %1 Cl 11,59; И 20,61;
С 43,17; Н 6,05.
С,, Н И О уС1 (611,51) .
Найдено, %: С1 11, 18; N 20. 07;
С 43,21; Н 6,02.
Пример 3. Альфа, эпсилон-.
-бис-(И-нитрозо-N (бета-хлорэтил).карбамоил )-лизилпролилвалинаиид.
К 552 мг (1 ммоль) альфа, эпсилон-бис-(бета-хлорэтилкарбамоил)лизилпролилвалинамида добавляют 10 мл
997-ной муравьиной кислоты, после чего в течение 1 ч в эту смесь добавляют по каплям раствор 500 мг нитрита натрия и 3 мл воды. На следующий день реакционную смесь выпаривают в вакууме. Остаток обрабатывают водой, фильтруют и промывают водой.
Таким образом получают 460 мг указанного соединения. Выход 75%.!
Rg = 0„80 (смесь метанола с этилацетатом в соотношении 1:3, тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Кизельгеля G).
Е = 184 (N-нитрозогруппа, 397 нм).
Вычислено, %: Cl 11,59; И 20,61;
С 43,17; Н 6,05.
С Н „И О С1 (611,51) .
Найдено, 7; Cl 11,41; N 20 10;
С 43,16; Н 6,04.
1414851
Пример4. а) Альфа-N-нитрозо-И- (бета-хлорэтил) -эпсил он-трет-бутилоксик арб ониллизилпролилв алин амид.
614 мг (1 ммоль) эпсилон-трет-буток-5 сикарб амоилли зилпр олилв алин амиддозилата растворяют в 10 мл безводного диметилфорамида, после чего в приготовленный раствор добавляют 0,14 мл (1 ммоль) триэтиламина, 274 мг (1 ммоль) N-нитрозо-бета-хпорэтилкарбамоил-и-нитрофенола и 136 мг (1 ммоль) 1-оксибензотриазола и реакцию проводят аналогично изложенному в примере 2. Таким образом получают
250 мг указанного соединения . Выход
43Х.
Нг укаэанного соединения 0,90 (смесь хлороформа с метанолом в соотношении 9:1, тонкослойная хроматографическая обработка с использованием
Кизелвгеля G); Кг 0 92 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотнощении 60:20,6: 11); Нг исходного соединения 0,80 (смесь
И-бутанола с ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 4 1: 1; тонкослойная хроматографическая обработка с использованием Киэельгеля 0).
Е 90 (И-нитрозогруппа, 39? нм).
Вычислено, Ж: С1 6,15; И 17,02.
С 4Н4 И 10 С1 (576, 10) °
Найдено, Х: С1 6 ° 00, И 16,61. б) Альфа-(И-нитроэо-И- (бета-хлорэтил) -карбамоил )-лиэилпролилвалин- Зб амидгидрохпорид.
200 мг альфа-(И-нитрозо-п-(бетахлорэтил)карбамоил)-эпсилон-трет-бутоксикарбоннллизилпролилвалинамнда смешивают с 6 мл 0,17 н,раствора муравьиной кислоты в соляной кислоте и раствору дают постоять в течение 5 мин с последующим его выпариванием. Остаток растворяют в воде и экстрагируют этилацетатом. Водный слой лиофилизируют. Таким образом получают 140 мг указанного соединения.
R = 0,10 (смесь н-бутанола с ледянои уксусной кислотой и водой в со- ВО отношении 4:1:1, продукт Кизельгель
С) s Rg = 0,64 (этилацетат, пиридин,." ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:40:12:22); Rg = Os1 (метанол и этилацетат в соотношении
ЗФ1).
Вычислено, ; С1 13,84; N 19, 13;
С 44,49; Н 6,83.
С 14Hg.>NqOgC1 i (512,44) .
Найдено, : Cl 13,72; N 18,81;.
С 44,51; Н 6,80.
E = 88 (N-нитрозогруппа, 397 нм) .
П р и и е р 5. Бета-хлорэтилкарбамаилтриптофилнорлейцил-альфа-аспарагилфенилаланинамид.
615 мг (1 ммоль) триптофилнорлейцил-альфа-аспарагнлфенилаланинамидгидрохлорида растворяют в 6 мл безводного диметилформамида, после чего в приготовленный раствор добавляют О, 14 мл (11 ммоль) триэтиламина и 0,1 мл (1,2 ммоль} бета-хлорэтилнзоцинатан дальнейшую часть реакции проводят аналогично изложенному в примере 1. Таким образом получают
600 мг указанного соединения. Выход
88Х. Т.пл. 201-202 С.
Вычислено, Х: Cl 5 ° 18; N 14,33;
С 57,883 Н 6,14 °
СЗ Н4 И7О С1 (684 ° 19) в
Найдено, Х: Cl 4,94; N 13,7 8;
С 57,86; Н 6,12.
R = 0„70 (бутанол, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4 з 1: fò :Ì ) р R g - 0,69 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:20:6:11).
П р и и е р 6. И-йитрозо-И-(бета хлорэтил) карбаиоилтриптофилнорлей» цил-альфа-ас пар агилфеимпаланинаиид.
684 иг (1 ммоль} бета-хпорэтилкарбамоил-триптофилиорлейцил-альфааспарагилфенилаланинамида используют для реакции с раствором 300 мг нитрита натрия и 2 мл сложного э4ира аналогично изложенному в примере 3. Такйм образом получают 605 .аг укаэанно го соединения Выход 35Х.
Rg 0,80 (смесь н-бутанола с,ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 4:1:1, Кизельгель С); R j
0,42 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении -120:20:6:11) р Кг 0,72 (бутанол, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4:1:1:1).
Вычислено, : Cl 4 97; N 15 71;
NO 4,20; С 55,52; Н 5,75 °
С УН + Найдено, : С 4,73; И 15,28; NO 3,87; С 55,50; Н 5,77. Поскольку в диапазоне нитрозогруппы имеет место поглощение самого пептпда, в данном примере нитрозную группу определяют по методу Лоо и Диона. 1414851 5 Пример 7. N-Нитрозо-N-(бета-хлорэтил) карбамоилтриптофилнорлейцил-аль фа-ас п ар агилфе нил алан ин амид. Аналогично изложенному в примере 1 проводят реакцию 92 1 r (1,5 ммоль) триптофилнорлейцил-альфа-аспарагилфенилаланинамидгидрохлорида 0,21 мл (1,5 ммоль) триэтиламина, 420 мг (1,5 ммоль) N-нитрозо-бета-(хлорэтил-. )О карбамоил)-и-нитрофенола и 200 мг (1«5 ммоль) 1-оксибензотриазола, Таким образом получают 800 мг указанного соединения. Выход 75 .. R g = О, 80 (смесь н -бутанола, ледя- )В ной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1, Кизельгель G). Вычислено, : С1 4,58; N 15 32; NO 3,92; С 55,52; Н 5,75. С »,Н,И gOg С1 (713,20) . Найдено, .; Cl 4,58; N )5 32; NO 3,92; С 55,51; Н 5,73. Нитрозную группу определяют по методу, указанному в примере 6, Пример 8. N-Нитрозо-N-(бэта- 2я -хлорэтил)карбамоилтриптофиллейцил-альфа-аспарагилфенилаланинамид (III). а) 633 мг (1 ммоль) триптофиллейцил-альфа-аспарагил-бета-трет-бутилэфир)фенилаланинамида дают постоять в 6 мл 2 н.раствора этилацетата в соляной кислоте, после чего добавляют в смесь диэтилового эфира, выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают и промывают диэтиловым эфиром. В результате получают 590 мг (выход 93 ) указанного продукта, R = 0,70 (бутанол, пиридин, ледяная уксусная кислота. и вода в соотношении 4:1:1:1); Rg = 0,74 (смесь бутанола с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 30:20:6:24; Кизельгель G); R< = 0,66 (бутанол, ледяная уксусная кйслота и вода в соотношении 4:1;1)3 R л =. 0,10 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 120:20:6:11). b) 92 ) мг (1,5 ммоль) триптофиллейцил.-альфа-аспарагилфенилаланинамидгидрохлорида растворяют в 10 мл абсолютированного диметилформамида, затем добавляют 373 мг (1,5 ммоль) N-нитрозо-бета-хлорэтилкарбамоил-¹ оксисукцинимида и 0,42 мл (3 ммоль) триэтиламина, После перемешивания в течение 15 мин диметилформамид отгоняют в вакууме, Остаток растирают в воде, отфильтровывают и промывают водой. В результате получают 980 мг (выход 92 ) укаэанного продукта. R = 0,69 (смесь этилацетата с пиридином, ледяной уксусной кислотой и водой в соотношении 30;20:6:11, Кизельгель G) Rg = 0,42 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 120;20:6:11); Rg = 0,72 (бутанол, пиридил, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 4;1;1:1). Вычислено, : Cl 4,97; N 15,71; NO 4,20; С 55,52; Н 5,75» С 1 Н " N 808 Cl (713,20) . Найдено, .: С 4«58» N 15,32; NO 3,95; С 55,49; Н 5,78. Пример 9. а) Альфа-N-нитроэо-И- (бета, хлорэтил) карбамоил-эпсилон-трет-бутилоксикарбонилглициллизилпролилвалинамид, 1,30 мг (2,6 ммоль) эпсилон-третбутилоксикарбонилглициллизилпролилвалинамида растворяют в 13 мл абсолютированного диметилформамида, а затем в приготовленный раствор добавляют 650 мг (2,6 ммоль) N-нитрозо-бета-хлорэтилкарбамоил-N-оксисукцинимида и 0,36 мл (2,6 ммоль) триэтиламина. После перемешивания в течение 15 мин реакционную смесь выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и экстрагируют водой. Этилацетатную фазу сушат и выпаривают. В результате получают 1,29 мг (Выход 80 ) ук аз анн or о пр одук та. R = 0,87 (этилацетат, пиридин« ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60:20:6:11); Rg = 0,82 (смесь хлороформа с метанолом в соотношении 8:2; Киэельгель G); Н г= 0 50 (этилацетат, пиридин, уксусная кислота и .вода в соотношении 120:20:6: :11) . Вычислено, .: Cl 5,60; N 17,69, С 1 Н N OgCI (633,16). Найдено, : Cl 5,48; N 17,31. Е = 91 (N-нитрозная группа, 397 нм) . Ь) Альфа-N-нитро э o-N- (бета, хлорэ тил) к арб амоил глициллиз ил пр олилв алинамидгидрохлорид (ТЧ). 633 мг (1 ммоль) альфа-N-нитрозо-N-(бета-хлорэтил)карбамоил-эпсилон-трет-бутилоксикарбонилглициллизилпролилвалинамида выдерживают в спокойном состоянии в течение 5 мин в 10 мл 0 14 н. раствора муравьиной. кислоты в соляной кислоте, а затем 1414851 45 раствор выпаривают. Остаток растворяют в воде и экстрагируют этилацетатом. Водную фазу лиофилизуют. В результате получают 540 мг (выход 957.) 5 указанного продукта. R = 0,1 (метанол и этилацетат в соотношении 3:1); R1 = 0,65 (смесь этилацетата. с пириднном, муравьиной кислотой и водой в соотношении 60:20; 10 :6;5,5; Кизельгель G); Rg = 0,66 (этилацетат, пиридин, ледяная уксусная кислота и вода в соотношении 60: :40:12:22), Вычислено, Е: С1 12,45; N 19,67; С 42,24; Н 6,67. С „Н ВИ8О С1 (569,59) . Найдено, 7: Cl 12,01; N 18,87; С 42,22; Н 6,69. с. = 84 (N-нитрозная- группа,396 нм) . 2 Пример 10, N-Нитрозо-N-(В-х торэтил) карбамоилпролилвалинамид, 1,37 r (5 ммоль) пролил валинамидацетата суспендируют в 15 мл безводного диметилформамида и добавляют при 25 перемешивании и охлаждении снегом 1,4 мл (10 ммоль) триэтиламина и 1,25 r (5 ммоль) сложного N-нитрозо-N-(Â-хлорэтил) карбаминовая кислота-N -оксисукцинимидного эфира. После перемешивания в течение 15 мин при . О С реакционную смесь разбавляют ледяной водой и осажденное соединение отфильтровывают и промывают холодной водой на фильтре. Продукт сушат в 35 эксикаторе над Р О .Выход О, 91 r (53K) . Rg = 0,8 (смесь хлороформа и метанола в соотношении 8:2, Кизельгель G). Т. пл. 1300 С (разложение) . (а() 49,04 (с = 1, Me0H); (a ) — 54,25 (с = 1, МеОН). Вычислено, Ж: С 44,85; Н 6,33; Cl 10,19; N 20,13. С Н N 0+ Cl (347,8) . Найдено, 7: С 144,83; Н 6,35;: Cl 9,86; N 19,76. Е = 88 (400 нм). Пример 11. 4 -(N-Нитрозо-И-(В-хлорэтил) карбамоил1-Я-трет-бутилоксикарбонилтриптофилглициллизил50 пр олилв алин амид. К смешанному раствору Hs 1,2 r (1, 74 ммоль) трет-бутилоксикарбонилтриптофилглициллизилпр олилв алин амида и 10 мл безводного диметилформамида добавляют при О С 0,24 мл 1,74 (ммоль) 55 триэтиламина и 400 мг (1,6 ммоль) N-нитрозî-N-(В-хлорэтйл)карбамоил-N-оксисукцинимида. Через 0,5 ч реакционную смесь выпаривают. Ост ато к растворяют в этилацетате и экстрагируют водой. Органический слой высушивают над безводным сульфатом натрия и выпаривают. Выход 1,2 г (853). R = 0,25 (смесь хлороформа и метанола в соотношении 9 1). Вычислено, 7.: N 17 09; Cl 4,33. С31Н55 N, ОуС1 (819,37) е Найдено, X: N 16,72; С1 4,01. Пример 12. 4 -(N-Нитрозо-N-(8-хлорэтил) карбамоил) триптофилглициллиз илпр олилв алинамидацет. 819 мг (1 ммоль) Ы-(N-нитрозо-N)-8-хлорэтил)-карбамоил-трет-бутилоксикарбонилтриптофилглициллизилпролилвалинамида дают отстояться в течение 5 мин в 10 мл 0,12 н, муравьиной кислоты с хлористоводородной кислотой, затем раствор упаривают в вакууме. Остаток растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом. Водную фазу лиофилизируют, затем лиофилизированный продукт очищают хроматографией на колонке, заполненной силикагелем в соотношении 60:20:б:11 смесью из этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды. После упаривания элюентной смеси, остаток растворяют в воде и лифолизируют, Таким образом получают 480 мг (637) соли. R = 0,25 (смесь этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 60:20:6:11). Вычислено, 7: С 52,36; Н 6,54; N 17,97; С1 4,55. С34Н 1 Н о09С1 (779,27). Найдено, Е: С 52,34; Н 6,54, N 17 00 Cl 4,46. Пример 13. o(-(N-Нитрозо-N-(B-хлорэтил)карбамоил)-5-трет-бутилоксикарбониллизилтриптофиллейциласпарагилфенилаланинамид. 1,4 г (1,73 ммоль) Е-трет-бутилоксикарбониллизилтрипФофиллейциласпарагилфенилаланинамида растворяют в 15 мл безводного диметилформамида при О С, В процессе перемешивания к смеси добавляют 0,24 мл (1,73 ммоль) триэтиламина и 433 мг (1,73 ммоль) N-нитрозо-N-(8-хлорэтил)карбамоил-N-оксисукцинимида. После перемешивания в течение 1>5 ч реакционную смесь выпаривают в вакууме, остаток растирают в порошок с водой и фильтруют, Сырой продукт растворяют в этаноле, осаждают водой и фильтруют. Таким образом получают 1,8 d продукта. Выход 677.. i0 дукт растирают s порошок со смесью простого эфира и петролейного эфира и фильтруют. Получают 360 мг (58%) продукта, эквивалентного конечному продукту примера 4. Пример 17. Осуществляют аналогично примеру 4, но вместо N-нитрозо-(В-хлорэтил)-карбамоил-и-нитрофенола используют (N-нитрозо-8-хлорэтилкарбамоил)-N-оксифталевый.имид, таким образом получают 400 мг (64%) конечного продукта, эквивалентного конечному продукту примера 4. Пример 18. Осуществляют аналогично примеру 4, но вместо N-нитрозо-(8-хлорэтил)карбамоил-и-нитрофенола используют (Н-нитрозо-Й-хлорэтилкарбамоил)пентафторфенол. Получают 510 мг (83%) конечного продукта, эквивалентного конечному продукту примера 4. Проводят биологические испытания предлагаемых соединений, при этом проводят сравнение с известчыми цитостатическими агентами: 1,3-бис- -(бета-хлорэтил)-1-нитрозомочевина (BCNY) и 2-(3-(2-хлорэтил)-3-нитро- . зоуреидо )-2-диокси-О-глюкопираноза (хлорозотицин), Фармакологическая активность предлагаемых соединений демонстрируется результатами испытаний с использованием в качестве испытуемых соединений o(,й-бис-(Н-нитрозо-N-(A-хлорэтил)карбамоил лизилпролилвалинамида (соединение I) и a -PN-нитрозо-N.-(В-хлорэтил)карбамоил лизилпролилвалинамид гйдрохлорида (соединение II). В табл. 1 показано влияние соединений 1 и II на внутрибрюшинно имплантированную мышам Ь 1210-лейкомию, Соединения I u II более активны,чем ВСМА и хлорозотицин, используемые в качестве сравнительных веществ. Опухолевый прививочный материал 10 асцитных клеток, внутрибрюшинно. Животное-хозяин — самки мьппей вида CDF. Лечение 3 дня. Токсичность— на 5-й день 4/6 остаются в живых. Критерий *- Т/С 7 125 — значительная противоопухолевая активность. В табл. 2 приведены фармакологические свойства соединения II (токсическая доза. 133-200 мг/кг внутрибрюшинно; вещество применяют на мышах, зараженных ? 1210), Приведенные данные доказывают,что новые пептидные производные соепине1414851 Rp = 0,83 (смесь бутанола, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1:1). Вычислено, %: N 14 87; Cl 3,76. С Н,И,О С1 (491,50). Найдено, %: N 14,74; Сl 4,12. Пример 14. o(-fN-Нитрозо-Nl- (В-хлор э тил) кар 6 амоилли зилт ри пт офил лейцилас параа гилфен ил ал анин амид. 941 мг (1 ммоль) d-(N-нитрозо-N -(й-хлорэтил) карбамоил3- Е -трет-бутилоксикарбониллизилтриптофиллейциласпарагилфениланинамида растворяют в 10 мл 0,12 н, муравьиной кислоты с Хлористоводородной кислотой. Раствор выпаривают в вакууме через 10 мин. Остаток очищают на колонке с силикагалем со смесью метанола, этилацетата воды в соотношении 2,5:1;0,5. Таким 20 образом получают 580 мг (69%) указанКого продукта. Rg = 0,66 (смесь бутанола, пирндина ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1:1), 2г, Вычислено, %: С 55, 62; Н 16, 30; М 16,64; Cl 4,20. С Н И О. С1 (841,36) . Найдено, %: С 55,64; H 6,28; N 15,65; Сl 3,96. ЭО Пример 15. c(-(И-Нитрозо-N«(B-хлорэтил) карбамоил 1- E -òðåò-бутилокси кар 6 ониллизилпр олилв алин амид (ис поль зуя N-нитро зо- (В-хлорэ тил)карбамоил-N-o сисукцинимид) . К раствору из 614 мг (1 ммоль) Н-лиз (БОК)-провал-NH„-тозилата и 10,мл безводного диметилформамида добавляМт 0,28 мл (2 ммоль) триэтиламина и 237 r (0,95 ммоль) N-нитрозо-(Я-хлорэтил)карбамоил-N-оксисукцинимида. После перемешивания в течение 30 мин рас тв ор упарив ают в вакууме . Остаток растворяют в этилацетате и дважцы экстрагируют водой. Этилацетатную фа45 зу сушат над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Получают 526 мг (86%) продукта. Rg = 0,92 (смесь этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 60:20:6:11). Найдено, %: N 16,63; Сl 6,02, Пример 16. Осуществляют аналогично примеру 4 с той разницей, что вместо N-нитрозо-(й-хлорэтил)карбамо Ил-II-нитрофенола используют P N-нитрозо-(8-хлорэтил) карбамоил пентахлорфенол и раствор экстрагируют насыщенным NaHCO, вместо воды, Конечный про1414851 В табл. 5 представлено влияние соединения II на выживание мышей, зараженных лейкемией L1210. Влияние соединения II на твердую опухоль (табл. 6). S+ - опухоль (подкожно). Дозировка 100 мг/кг или 5х х20 мг/кг внутрибрюшинно (лечение начинают на следующий день после трансплантации) оказалась неэффективной. Легочная меланома Льюиса и меланома Вц -опухоли, дающие на мышах метастазы (i.m.). Внутрибрюшинное применение, начиная со дня, следующего после трансплантации. Опухолевые ксенографты человека. НТ18 (амеланотическая меланома), Контроль - среднее значение ТД 100 мг/кг 22,5 дн. 50,0 дн.(Д 1,0) 5х20 мг/кг 56,25 НТ22 (слизистая карценома толстой кишки) . Контроль 17,0 дн. 100 мг/кг 24,0дн.(0,29) 5х20 мг/кг 21,5 дн. (0,26) НТ17 (аденоматоэная карценома толстой кишки). Контроль 16,5 дн. 100 мг/кг 14,75 дн. (0,0) 5х20 мг/кг 5,0 (О 0) Время лечения; при достижении объема опухоли примерно 8 мм . Метод лечения: внутрибрюшинно, ТД = удвоение объема опухоли. ТД е-ТД Ко GD = задержка роста = ТД„ где Ке — обработанные, КΠ— контроль, Влияние пептидо-нитрозомочевиновых производных на рост экспериментальных твердых опухолей и опухолевых ксенографтов человека. ния I. u II значительно более активны и менее токсичны, чем BCNY и хлорозотицин, используемые в качестве контрольных агентов ° Исследование связи между эффектом и химической структурой соединений, аналогичных соединению II на мышах, зараженных лейкемией L1210, приведено в табл. 3. Влияние соединения II в комбинации с фармацевтическими агентами на мышей, зараженных лейкомией L1210, приведено в табл. 4. Изученные соединения: N-нитрозо-N-(B-хлорэтил)-карбамоиллизилпролилвалинамид НС1; N-нитрозо-N-(8-хлор5 этил)карбамоилглициллизилпролилвалинамид НС1. Объекты: экспериментальная твердая опухоль: мышиная опухоль S 180, легочная опухоль Льюиса и мышиная меланома В (, опухолевые ксенографты человека: амеланотическая меланома НТ18, колоректальная аденокарцинома НТ17, колоректальная аденокарцинома НТ22 (слизистая), панкреатическая карцинома НТ27. Эксперименты на экспериментальных твердых опухолях S !80, Опухоль разрезают на мелкие кусочки и эти кусочки подкожно трансплантируют под шкурку спины мышей разновидности СЕРР, Лечение начинают со дня следующего после дня трансплантации, Размер опухолей измеряют кронциркулем, а объем рассчитывали по их диа25 метру. Соединение II (внутрибрюшинно) применяемое с дозами 100 мг/кг или 5х20 мг/кг (одна доза в пять дней) не оказывает влияния на рост опухоли. Легочная опухоль Льюиса. Зп Эту епухоль трансплантируют в виде клеточной суспензии в бедренную мьппцу инбридных мьппей С5781 при числе клеток 10 . Растущая опухоль индуцирует регулярные метастазы легких. Лечение начинают в день, следующий после дня трансплантации. Наблюдают выживаемость обработанных и контрольных животных. В -меланома. Опухоль транспзтантируют под шкУРУ 40 спины инбридных мьппей С5781 в виде кусочков опухолей, Рост опухоли индуцирует метастазы легких. Лечение н оценку действия проводят методом> 45 аналогичным описанному для случая легочной опухоли Льюиса. Результаты, относящиеся к LLT и В -меланомам приведены в табл. 7. Согласно полученным результатам 5р соединение II умеренно удлиняет время жизни животных включая LLT и В У Я меланомы. Степень эффекта ингибирования практически равна эффекту ВСИ7, Изучение опухолевых ксенографтов человека. Кусочки серийно трансплантируемых опухолей (взрослая тимектомия, полное облучение с 8,5 Gy, перестройка 1414851 Объем обработан- ных" опухолей к 21-му дню — объем обработанной Эффект ингиб„р „ МОО " О д " 100; опухоли Объем контрольной опухоли на 21-й день — объем контрольной опухоли в О день 30 (100 означает полное ингибирование роста опухоли). 35 Результаты экспериментов показывают, что пептидонитрозомочевинные производные значительно ингибируют рост амеланотических меланом,тогда как их влияние на рост опухолей тол- 40 стой кишки и поджелудочной железы несколько ниже (табл. 8), Опухоль-ингибирующий эффект N-нитрозо-(й-хлорэтил)карбамоилпептидных 45 фрагментов на лейкемию мьппей L 1210 приведен в табл. 9. в=с -сн, сн,и-с=о! I 1 0N qg,, — не определялась. 50 мозгового вещества с помощью 5 10 сингенных медулярных клеток) трансплантируют под шкурку спины искусственно иммунодепрессированных мышей разновидности СВА/Са, 5 Внутрибрюшинное введение лекарст,; :ва начинают тогда, когда опухоли дос тигают диаметра 0,7" 1,0 см и можно : наблюдать их прогрессирующий рост. Диаметры опухолей измеряют кронцирку/ лем и их объем рассчитывают на осно" ве их диаметра. (Y = К/бхР, D — средний диаметр). Степень эффекта ингибирования опухоли определяют на осно вании разности объема опухоли измеренного на 21-й день после трансплантации в контрольной и обработанной группе (каждая экспериментальная группа включает по крайней мере шесть 2С опухолей). Оценку опухоль-ингибирующего эффекта относительно L1210 проводят следующим образом, 10 клеток лейкемии L1210 внутрибрюшинно трансплантируют мышам. Лечение начинают в первый день после трансплантации, Соединения, подлежащие изучению, вводят в виде физиологического раствора (NaC1) или 2 .-ного буффера твин 80, содержащего 5 . диметилсульфоксида, Выживаемость Выживаемость обработанных контрольных П.Б — "" ей — мышей Выжив а ем о ст ь кон т роль ных мышей Критерий: ILS % — значительный опухоль-ингибирующий эффект, Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что предлагаемые соединения являются эффективными цитостатическими агентами и что эти новые соединения являются более эффективными цитостатическими агентами, чем известное BCNY u хлорозотицин, Причем аналог по структуре; o(С = -бис-(2-хлорэтил)карбамоил-Lys-Pro-Val-NH не обладает цистостатической активностью. Определение токсичности предлагаемых соединений, проведенное на мышах вида С 57 BL х DBA, показывает, что они могут быть отнесены к категории среднетоксичных соединений. Формула изобретения - N-Нитрозо-N-(бета-хлорэтил)карбамоилпептиды общей формулы NO ! (cl-сн,сн,нсснн R где п=1; R — Lys Pro Val NH,, Trp Leu a Asp Phe NH,, Pro Val NH,, Gly Lys Pro Val NH,, Trp Gly Lys Pro Val NH, или n = 2; R — Lys Pro Val NH, нли их хлоргидраты, обладающие противоопухолевой активностью, 14 4851 16 Таблица 1 МЯТ- ффективность, %, Т/C** Средний период выживания MST дни Число Испытуемое Доза, соединение IP мг/кг Средняя потеря в весе на 5-й живых мьппей к 5-му дню (47) ень г — 1,4 6/6 (5) -О, 8 6/6 (5) BCNY Соединение I 6/6(-). 6/6(2)" 6/6(3) -1,5 -0,6 -0,8 Соединение II 150 100 40 Хлорозотнцин 48 16 9,0 150 +1,2 Физиологический Контроль +2 5 раствор NaC1 *Обе мьппи больны. ИЯТ обработанной группы х 100. ** ST контрольной группы Т аблица 2 Дозировка (внутри- ?Ь$, брюшинно), мг/кг Зх10 3 х 50 1х 133 1 х 200 150 Токсично 40 47,0 783 30 47р0 783 200 8 ° 5 142 130 12,0 200 70 47,0 783 10,5 175 47,0 783 29,5 492 13,0 217 14,0 233 8,5 142 47,0 783 20,5 342 -1,1 -0,7 -0,5 -0,7 -0,3 -1,3 -1,2 -0,8 6/6(1) 6/6(3) 6/6(2) 6/6 (-) 6/6(-) 6/6 (-) 5/6 (3) 6/6(-) 6/6 (-) 10/10(-) 1414851 18 Таблица3 Соединение Доза, мг/кг ПS 7. 28 50 100 Токсично 15 45 100 150 230 Таблица 4 Применение лекарства ILS X Выживание, Доза, мг(кг Дни Ж 12 5 50 0 325 325 1х25 7 II 8 Циклофосфамид 1х50 9 Дибромдульцит 10 BCNY 11 Лечение соответствует 7+ 8 1х50 1х10 77 12 Лечение соответствует 7+9 13 Лечение соответствует 7+ 10 14 II 15 BCNY 1х50 1х20 16 Лечение соответствует 14+ 15 Опыт С о единение 1 II 2 II 3 BCNY 4 BCNY 5 Лечение соответствует 2 + 3 6 Лечение соответствует 1 + 4 1 . 50 1 87 1 25 1 110 1414851 Т.аблица 5 Выживание***, 7о ILS** Z Лечение Соединение оза, мг/кг Дни" 1 х12,5 1х50 1 х 133 1z25 44 45 250 110 *Внутрибрюшинно, применение в отмеченный день после трансплантации. Время выживания обра- Время выживания необботанных мьппей — работанных мьппей Время выживания необработанных мьппей х 100. ***Выживание на 60-й день после. трансплантации. Т аблица 6 В -меланома Опухоль Льюиса Доза,мг/кг Средняя дли- ILS 7 дельность выживания, дни Средняя дли- ILS 7 тельность выживания, дни 21,0 26,0 Контроль Соединение II 100 22,0 31,5 21,5 27,0 5х20 35,0 BCNY 28,5 25,0 42,0 34,0 5х4 1 х 25 1 х 100. Зх10 3-х 50 4 х 10 1;5; 9 1;5; 9 1 i2 5s6 1414851 22 Табли а 7 LLT Средняя выживаемость,дни Лечение ILS,% ILS*,% Средняя выживаемость,дни 26,0 Контроль 21 0 31,5 35 0 22,0 5%20 27,0 BC мг/кг 42,0 61 34,0 31 28,5 25,0 OILS - увеличение выживаемости. Таблица 8 Эффект ингибирования опухоли, % НТ18 50 мг/кг Соединение формулы ЕХ 40 100 мг/кг 5х20 мг/кг 77 68 Соединение формулы 57 НТ17 Соединение формула II НТ22 Соединение формулы II НТ18 10 мг/кг 20 мг/кг BC_#_Y Таблица 9 Испытуемое соединение оза (внутрибрю шинн о г/кг г/кг BCNY 0 028 55 О, 052 78 О, 112 .115 0,212 Токсично 20 КРгоЧ&1БН а 30 187,2 40 136 80% 100 Соединение II мг/кг: 100 О, 056 0,112 0,230 0,280 ILS,X Время 9у жизни мнн 1414851 23 Продолжение табл.9 ILS,Õ Время Ь оза (внутриб шинно Испжуемое соединение Йиэни, k-Lys-Pro-Ча1-NH,НС1 200 0,560 0,024 0,048 12,5 29,8 25,0 0,097 100 100 0,195 263 150 0,254 0 390 607. R-Gly-Lys-Pro-Ча1-NH,НС1, 200 27 25,8 0,043 О, 087 О, 175 48 100 100 200 0,351 О, 015 0,030 0,061 R-Trp-G1y-Lys-Pro-Val-NH, НС1 19,9 100 300 100 О, 122 0,244 607. 200 60% 300 0,366 0,070 О 140 0,210 160 R-Trp-Leu-Asp-Phe-NH nd 100 150 230 200 0,280 O, Р -бис(2-Хлорзткфарбаноил 1ув-Pro-Чаl-NH, 0,018 0,036 О» 144 0,109 0,085 20 50 Н-?.уз-Pro-Чаl-МН, -2СН, СООН Н-Lye-Pro-Gly-Lys-Pro-Val-NH 50 Составитель В. Волкова Техред М.Ходанич Корректор C. Шекмар Редактор H. Яцола Заказ 3845/26а Тираж 348 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4
