Способ получения гликозидных антибиотиков ввм-2478а и ввм- 2478 в антибиотического комплекса ввм-2478

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производств не антибиотиков. Способ заключается в том, что неидентифицированньш аспорогенный штамм актиномицета С 907- 21 АТСС 39417 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей необходимые питательные компоненты, в условиях аэрации и перемешивания при 27-32°С в течение 6-10 сут. Полученную культуральную жидкость разделяют на мицелий и культуральшай бульон, мицелий экстрагируют метанолом , а культуральньй бульон бутанолом. Экстракты объединяют и очищают хроматографически с получением неочищенного комплекса ВВМ-2478. Затем повторно хроматографируют, элюируют смесью, хромоформа и метанола при возрастании концентрации последнего в смеси от 5 до 10%. Фракции, полученные при элюации с использованием 5% метанола, содержат антибиотик ВВМ-2478В, а фракции, элюированные при концентрации метанола 10% - антибиотик ВВМ-2478А. Антибиотики проявляют антибактериальную активность в отношении аэробных грамположительных и анаэробных бактерий. Кроме того, антибиотик ВВМ-2478А проявляет и противоопухолевую акт1шность. 1 табл.

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК

0% (И) А3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

, "4

1:

БЕБЛй,:!;Г °

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

AO ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3805267/28-1 3 (22) 02. 10. 84 (31) 538453 (32) 03.10.83 (ЗЗ) US (46) 07.09.88. Бюл. Я 33 (71) Бристоль-Мейерз Компани (US) (72) Масатака Кониси, Коко Сугавара, Такео Мияки и Хироси Кавагути (ЛР) (53) 615.779. 93 (088. 8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОЗИДНЫХ

АНТИБИОТИКОВ ВВМ-2478А и ВВМ-2478В АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ВВМ-2478. (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производст- ве антибиотиков. Способ заключается в том, что неидентифицированный аспорогенный штамм актиномицета < 90721 АТСС 39417 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей необходмые питательные компоненты, в условиях аэрации и перемешивания. (5И 4 С 12 Р 19/46 // (С 12 Р 19/46, С 12 R 1:04) при 27-32 С в течение 6-10 сут. Полученную культуральную жидкость разделяют на мицелий и культуральнйй бульон, мицелий экстрагируют метанолом, а культуральный бульон бутанолом. Экстракты объединяют и очищают хроматографически с получением неочищенного комплекса ВВМ-2478.

Затем повторно хроматографируют, элюируют смесью хромофэрма и метанола при возрастании концентрации последнего в смеси от 5 до 10%.

Фракции, полученные при элюации с использованием 5% метанола, содержат антибиотик ВВМ-2478В, а фракции, элюированные при концентрации метанола 10% — антибиотик BBM-2478А.

Антибиотики проявляют антибактериальную активность в отношении аэробных грамположительных и анаэробных бактерий. Кроме того, антибиотик

ВВМ-2478А проявляет и противоопухолевую активность. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения новых гликоэидных антибиотиков, проявляющих антибактериальную активность в отношении . азробных грамположительных и анаэробных бактерий, а также противоопухолевую активность.

Для осуществления способа используют штамм ь 907-21 - неиденти" фицированиый аспорогенный актиномицет.

Культурально-морфологиче ские признаки. Штамм 907-21 образует длин- . ньп3 хорошо разветвленный вегетатив ный мицелий шириной 0,4 мкм, кото1 рый не разделяется на полочки или, коккоидные клетки. На некоторых агаровых средах иногда образует ру:диментарный короткий воздушный мицелий, но реальный воздушнйй мицелий не образует ни на одной из описываемых сред. Образующие споры тела и опоры не обнаружены.

Клеточная оболочка содержит мезодиаминопимелиновую кислоту, а гидролизат клетки — мадурозу, что позволяет отнести штамм к типу ХХХв клеточных оболочек. сутствует, растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета " рост умеренный.

ЗО Суб стратный мицелий от темно-сероватого, желтого (91) до темно-оливкового, коричневого (96).Воздушный мицелий отсутствует или очень скудный, если образуется - рудиментарный желтовато-белый (92), растворимый пигмент ярко-желтый (85).

Агар, содержащий пентон, экстракт дрожжжей, железо (ISP И 16), " рост умеренный. СубсФратный мицелий от све тло-оливкового, коричневого (94) до ярко-желтов ато го, коричневого (75) . Воздушный мицелий отсутствует.

Растворимый пигмент блестящий оранжено-желтый (67) .

Агар VDYA — рост обильный. Субстратный мицелий от ярко-густого красного (14) до черновато-красного (21) .

Воздушный мицелий отсутствует. Ра" створимый пигмент темно-красный (16) .

Агар с кукурузной мукой - рост обильный. Субстратный мицелий от ярко-желтоватого коричневого (75) до темно-желтоватого коричневого (78).

Воздушный мицелий отсутствует. Раст55 воримый пигмент густой коричневый {55).

Агар С-2 — рост слабый. Субстратный мицелий светло-желтова1ый, корич" невый (75). Воздушный мицелий отсутБульон, содержащий трут тон и экстракт дрожжей(ХБР У 1). — рост слабый, флоккоза, бледно-желтые шарики.

Диффундирующий пигмент отсутствует.

Агар Чапека — рост отсутствует, субстратный мицелий от желтоватобелого (92) до светло-оливкового, коричневого (94). Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует. Окраска и числа в скобках соответствует стандарту окраски по шкале цветов.

Агар с глюкозой и апспарагниом— рост слабый. Субстратный мицелий от

Фелтовато-белого (92) до умереннооливкового, коричневого (95). Воздушный мицелий отсутствует, растворюаай пигмент отсутствует.

Агар с неорганическими солями и крахмалом (ХЯР В 4) - рост слабый.

Субстратный мицелий сероватый, желтоватый, коричневый (80). Воздушный мицелий отсутствует или очень скудныйв е Н образуется рудиментарный желтовато-белий (92), растворимый пигмент темно-сероватый, .желтоватый, коричневый (81) .

Гирозиновый агар (ХБР Р 7) - pocr умеренный. Субстратный мицелий от серовато-желтого (90) до ярко-желто" ватого, коричневого (75) . Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар — рост слабый.

Субстратный мицелий от ярко-желтого

{85) до темно-оливкового, коричневого (96). Воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует.

Агар, содержащий экстракт дрожжей н экстракт солода (ISP У 2), " рост умеренный. Субстратный мицелий от желто-сероватого, желтого {91) до темно-оливкового коричневого (96) .

Воздушный мицелий отсутствует или очень скудный, если обраэуетсярудиментарный, светло-сероватый, желтоватый, коричневый (79), растворячый пигмент темно-желтоватый, коричневый (78).

Агар с овсяной мукой (ISP N 3)рост умеренный. Субстратный мицелий от желтовато-белого (92) до сероватожелтого {90) . Воздушный мицелий очз

142 ствует нли очень скудный, если образуется — рудиментарный, белый (263).

Растворимый пигмент отсутствует.

Агар из картофеля и моркови - рост от слабого до умеренного. Субстратный мицелий от серов ато-желтого (90) до темно-желтоватого, коричневого (78) .

Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент темно-желтовато-розовый (30) .

Колония на среде ISP N 2 — рост хороший, значительно разбухшая и многослойная, диаметр 3-5 мм, поверхность имеет красновато-черную окраску, воздушный мицелий не образуется совсем или образуется рудиментарный воздушный мицелий.

Данные о культуральных признаках о получены после инкубации при 28 С s течение 3 недель.

Физиолого-.биохимические свойства.

Максимум роста при 28 и 37 С. Не растет при 7 и 45 С. Диапазон температуры роста 15-43 С. Рост при рй 5,0

11,0. Отсутствует рост при рН 4,5.

Желатин разжижае т. Крахмал гидролизует. Снятое молоко не коагулирует, полностью пептонизирует. Иелаиоидные

"пигменты не образует. Реакция тирозиназы отрицательная. Нитрат в нитриты не восстанавливает. Чувствительность к NaC1 растет при 4Х NaC1 и ниже, не растет при 5Х NaC1, Чувствителен к лизоциму. Рост отсутствует при 0,001Х лизоцима.

Утилизация углеводов. Утилиэирует глицерин, d(-)-арабинозу, 1(+)-арабинозу, Й-ксилозу, Й-рибозу, оС -раминозу, d-глюкозу, d-галактозу, Йфруктозу, d-маннозу, d-маннит, салицин, целлобиозу, трегалозу, не утилизирует 1(-)-сорбозу, сахарозу, лактозу, мелионозу, раффинозу, d(+)-мелеэитозу, целлюлозу, дульцит, инозит, d-сорбит.

Пример 1. Хорошо растущую на скошенном агаре культуру штамма

: < 907-21 используют для прививки вегетативной среды, содержащей ЗХ растворимого крахмала, 1Х бакто-печени, 0,5Х рыбной муки, О,ЗХ КаС1, 0,1Х (ЙН4), 804 и О, 6Х СаСО, рН 7,0 перед стерилизацией среды. Вегетативную о среду инкубируют при 28 С в течение .72 ч на роторном вибраторе (250 об/мин), и 5 мл среды с культурой переносят в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл ферментационной

3001

4 среды указанного состава. Ферментацшо осуществляют на роторном внбраторе а при 28 С в течение 7-10 дней, контролируя антибиотическую активность с помощью тест-культуры Micrococcus

luteus РСТ 1001. Максимальная антибиотическая продуктивность 150 мкг/мл на 6-7 сутки ферментации.

10 Пр им е р 2. Из 20л культуральной жидкости (рН 6,8) отделяют лепешку мицелия центрифугированием.

Лепешку мнцелия экстрагируют 3 раза порциями по 5 мл метанола. Иетаноло15 вые экстракты фильтруют, соединяют и концентрируют под вакуумом до водного раствора.

Супернатант, полученный после от-. деления мицелия, экстрагируют 20 л

20 н-бутанола, и экстракт упаривают под вакуумом до водного раствора.

Два водных концентрата объединяют и пропускают. через колонку Диаинон

ГЦ-20, элюируют последовательно 5 л

25 воды, 5 л 50Х-ного водного раствора метанола и 8 л 80Х-ного водного раствора метанола.

Фракции, содержащие антибиотическнй комплекс BBM-2478, определяют с

3g помощью метода дисков и тест-культуры Bacillus subtilis И45 (Rec.).

Активные фракции, элюированные

80Х.-ным водным раствором метанола, собирают, выпаривают при пониженном

35 давлении и сушат вымораживанием. Получают 4,5 г желтого твердого вещества — неочищенный комплекс ВВМ-2478.

Полученное вещество пропускают через колонку из силикагеля (3,5 х х 55 см), предварительно промытую хлороформом, и активный агент элоируют смесью хлороформ — метанол с постепенным увеличением концентрации метанола от 5 до 10 об.Х, Пер вую активную фракцию, элюированную

5Х-ным раствором метанола, собирают, концентрируют под вакуумом и лиофилизируют. Получают 72 мг ВВМ2478В.

Вторую активную фракцыо, элюированную 10Х-ным раствором метанола, обрабачъюают аналогичным способом.

Получают 2,51 r полуочищенного твердого вещества ВВИ-24788. Зто веще55 ство подвергают последующей .хроматографии на силикагеле с использованием жидкостной хроматографии среднего давления. Злоируют сме сь хлороформ: метанол (97:3 об/об), получают ак5 1423001 6 тивные фракции, которые концентри" тически не растворяется в других ор-. руют. под вакуумом. Получают одно- ганических рас гворителях. Раствориродное твердое вещество — 1 3 r мость BBM-2478В аналогична раствориВВМ«2478А, кристаллизуют его из ме- мости А-компонента, но не растворяч ганола и получают желтовато-оранже- ется в подкисленной воде. вые иглы моногидрата ВВИ-2478А.

Физико-химические свойства анти- Антибиотики дают положительные биотиков. Антибиотики ВВИ-2478 АиВ - реакции на хлорнд железа (III) и антжелтовато-оранжевые кристаллические 10 роновые реагенты. Реакции Толлера и твердые вещества. ВВМ-2478А легко Сакагучи отрицательные. растворяется s диме типсульфоксиде, ВВИ-2478А дает положительную редиметилформамиде, диоксане и подкис- акцию на нингидрин, В-компонент — оч ленной воде, слабо растворяегся в рнцательную. метаноле,зтаноле и хлороформе, прак- 15 Тонкослойная хроматография, R .

БхО

СНС13-Меон (7:3)

0,37

0378

ЯхО

ЕсоАС-МеОН (1:1)

0 16

0,57

ВВМ-2478А

ВВИ-2478

ВВМ-247 8А

ВВМ-247 8В,, Внешний вид

Состояние

Аморфный порошок

Аморфный порошок

Температура плавле" о ния, С

271-272 (с разложением) ) ) 2 дин) УФ

Структурная формула антибиотика

ВВИ-2478В:

+124

МеОН нм магас (Е1см ) 40

236 (590)

266(550)

333 (100)

З78(1З2)

398(205)

422(225) 236 (740)

266(700)

333(118)

378(169)

398(255)

422(290) О

Н0

Найдено, Х

С 58,28

Н 5,40

И 2,06

Рассчи- С, Н> Þ 40, тано, 7

С 59,01

Н 5,55 я 2,09

Структурная формула

ВВМ-2478А;

Биологические свойства (антибак50 териальная активность) антибиотиков ВВИ-2478 А и В представлены в таб лице.

63,07

4,51 с 25822 04О

63,16

4,48

Антибиотик ВВИ-2478А также обла.-. дае т значительной. противоопухолевой активностью. Протнвоопухолевую активность определяют на мышах против люафоцитной лейкемии Р 388, люг7 1 фоидной лейкемии L 1210 и меланотической меланомы В16.

Формула изобре тения

Способ получения гликозидных антибиотиков ВВМ-2478А и ВВМ-2478В антибиотического комплекса ВВМ-2478 общей формулы Н С

О

ОН

СНЗ

ОК осн

Минимальная ингибирующая концент-, рация (МИК), мкг 1 мл

Вид микроорганизма

ВВМ-2 47 8А ВВМ-2 478В

Staphylococcus aureus

209р

I 6

3,1

Staphylococcus aureus

Смита

6,3

0,8

Bacillus subtilis

РСТ 219

0,8

0,8

Micrococcus luteus

PCT 1001

0,8

1,6

0,8

Езcherichià coli NIRJ

100

Klebsiella pneumoniae DLL

100

Pseudomonas aeruginosa 915

«100 100

Candida albicans

IAN 4888

«100

«100

Cryptococcus neofor»

mans Д49

«1.00

«100

3 где R - водород (антибиотик ВВМ247 8В), Nicrococcus f lavus Д12

423001 8 (антибиотик ВВМ-2478А), заключающийся в том, что штамм не-, идентифицированного аспарогенного актиномицета Г 907-21 АТСС 39417 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при 27-32 С, затем

10 разделяют культуральный бульон и мицелий, мицелий экстрагируют метанолом, а культуральный бульон - бутанолом, полученные экстракты, содержащие антибиотический комплекс, объе15 дпняют и подвергают хроматографичес.<ой очистке, далее полученный целевой продукт пропускают через хромато графиче скую колонку, элюируют смесью хлороформа и метанола при воз20 растающей концентрации последнего от 5 до 10Х и выделяют антибиотик

ВВМ-2478В при содержании метанола в элюирующей смеси 5Х, а антибиотик

ВВМ-2478А — при 10Х.

1423001 10

Продолжение таблицы

Минимальная ингибирующая концент-. рация (ИИК), мкг 1 ил

Вид микроорганизма

ВВМ-2478А ВВМ-24788

Аврегф11пв fumigatus .ХАИ 2530

«100

Trichophyton mentagrophytes Д155

100

Bactегоides Хгарх1is

Clostridium difficile

Clostridium perfringens

Propionobacterium аспев

5О

Составитель Г.Смирнова РЕдактор И. Горная Техред Л. Сердюкова Корректор JI. Ïèëènåíêo

Заказ 4444/59 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 ° Москва, Ж-35, Рауиская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4