Способ стереоспецифического анализа триацилглицеролов

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 Г 01 N 33/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4146365/31-13 (22) 13.11.86 (46) 15.10.88. Бюл. Р 38 (71) Краснодарский политехнический институт (72) В.Г.Щербаков, В.Г.Лобанов, А.И.Кожухов и Е.В.Шж)гля (53) 664 . 12(088.8) (56) Юнусова С.Г. и др. Стереоспецифический анализ жиров. — Пищевая . технология, 1985, Р 2, с. 17-24. (54) СПОСОБ СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКОГО

АНАЛИЗА ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВ (57) Изобретение относится к масложировой промышленности, а именно к способам стереоспецифического анализа триацилглицеролов, и обеспечивает повышение точности анализа путем увеличения глубины фосфорилирования и повышения чистоты разделения продуктов фосфолиполиза. Способ предусматривает проведение фосфорилирования в атмосфере азота под давлением О, 10-, 0,15 ИПа при температуре (-10)— (-12) С с последующим нагреванием о до температуры 5-8 С и разделение продуктов фосфолиполиза препаративной тонкослойной хроматографией в двух системах растворителей — гексан:диэтиловый эфир и хлороформ:метанол:20Ж-ная гидроокись аммония в соотношении 60:40 и 80:20:2 (по объему) соответственно. 5 табл.

1430888

Изобретение относится к масложировой промышленности и касается способа стереоспецифического анализа триацнлглицеролов.

Целью изобретения является повышение точности анализа путем повышения глубины фосфорилирования и повышения чистоты разделения продуктов фосфолиполиза. 1О

Способ осуществляется следующим образом.

В коническую колбу на 50 мл помещают навеску триацилглицеролов 1 r и добавляют 4 мл 1 -ного раствора поливинилового спирта, 1 мл 22 .-ного раствора хлористого кальция,7 мл аммиачного буфера (1N NH4C1 + 1М ИНдОН; рН = 8). Смесь выдерживают в термостате 10 мин при 40 С, перемешивая содержимое мешалкой, и затем вносят в колбу 0,25 г предварительно обезжиренной ацетоном панкреатической липазы. Реакцию ведут 20-30 мин при о

40 С, постоянно перемешивая и добав- 25 ляя через каждые 10 мин 1 каплю 4N гидроокиси аммония. Для контроля глубины гидролиза через каждые 10 мин и последующие 5 мин реакции отбирают пробу и анализируют ее тонкослойной 30 хроматографией в системе растворителей петролейный эфир (40-60 С): диэтиловый эфир 7:3 (по объему). После подъема фронта растворителей и высу,шивания пластинки на воздухе прояв- 35 ляют пятна продуктов гидролиза в парах иода, обращая внимание на интенсивность пятна Sn-1,2-(2,3)-диацилглицеролов, подвижность которого характеризуется коэффициентом ВХ=0,3 40

При высокой активности липазы время гидролиза уменьшают до 5-10 мин, чтобы не допустить расщепления ди,ацилглицеролов до свободных жирных кислот и глицерина. 45

По достижении желаемой глубины гидролиза реакцию прерывают и добавляют к реакционной смеси 1-1,5 мл 4И соляной кислоты и продукты выделяют трехкратной экстракцией (по 10 мл) диэтиловым эфиром. Эфирные вытяжки объединяют, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, . сушат безводным сульфатом натрия, Растворитель удаляют на Роторном ис- 55 парителе.

Продукты гидролиза разделяют препаративной тонкослойной хроматографией на пластинках (20х20 см) с силикагелем, содержащим 5 . гипса (8 г сорбента на 1 пластинку), в системе о петролейный эфир (40-60 С): диэтиловый эфир 60:40 (по объему).

К остатку гидролизата после удаления диэтилового эфира добавляют

10 мл хлороформа и по 1 мл этого раствора наносят на 10 пластинок. В системе растворителей гидролизат разделяется на следующие компоненты: нерасщепившиеся триацилглицеролы (Rf

= 0,6) свободные жирные кислоты, отщепившиеся от Sn-1 в и Sn-3-положений (Rf = 0,6), сумму Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролов (Rf = 0,3) и 2-моноацилглицеролы (Rf = 0,07). Проявляют вещества, опрыскивая край пластинки 50 -ной серной кислотой и нагревая его или в парах йода.

Зоны силикагеля с веществом счищают с пластинок, переносят на воронку Шотта с фильтром N - 4 и с помощью водоструйного насоса смывают липиды с силикагеля несколькими порциями диэтилового эфира. Часть каждой фракции отбирают, жирные кислоты анализируют ГЖХ.

Равенство кислотных составов нерасщепившихся и исходных триацилглицеролов служит доказательством того, что липазный гидролнз не сопровождается изомеризацией. Совпадение состава вьщеленных для Sn-1,2 (2,3)-диацилглицеролов с рассчитанным теоретически доказывает их репрезентативность, т.е. отражает распределение кислот в исходных триацилглицеролах.

Теоретический расчет состава Sn-

-1,2(2,3)-диацилглицеролов . Х в

Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролах равно

3/4 Х в ТАГ + 1/4 Х в Sn-2-моноацилглицеролах, где Х вЂ” жирная кислота.

Жирнокислотный состав Sn-2-моноацилглицеролов характеризует набор кислот Sn-2-положения.

Для фосфорилирования Sn-1,2(2 3)-диацилглицеролов используют свежеперегнанный фенилдихлорфосфат. Навеску 0,07-0,12 г Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролов растворяют в 0 5-1,0 мл безводного диэтилового эфира и охлаждают в льдосолевой смеси до (-10)о (-15) С. Охлажденный раствор вещества по каплям шприцем приливают к предварительно охлажденной до (-10)/ (" (— ) (> 1 0 ) с сме c it 2 и., г >- «> !3o>(jii о>1{0 (!E!pEI-. .1((тнл 11 О, 25--0 50 I! (Све;, .((ттерет Hа IHOга фет(т!т(дихт(орт))0(фл л R атмосфере

Лялин (>ОИ т:З>.;г -((!l .,":»(Elt>T>Å (ттт О 1О, 15 )K)a. 1 еактьтвтту(о с.!есь после т) СТР Я ХИ13Л НИЯ O. Т>IBJI J((()T R ЭТИХ УСЛО г (>

Р!.(E1x нл 8-1(3 ч ттри »-8> С.

Затем в релкциант. -ю смесь 1. — и

» фосфлте:! 1(т(, >енс>л . з 111)и Ох>таждении

ri(>(>((TjJ(H(07 );. UI I(Hi)H >11т Hr1 3 м 1 Т(И) > u-!

I0I30га >фира и 5-7 клпелт,,пистилт нрав

I3>. l iHoli воДы, пецеп;)сЯ т 13 Це.И>тель -.1!i) воронку„злпаi ET(HHу(з 30 мл tpòàE(oëàl

25 м:, дисти,-т.! Hpoi)R!(11())) 1300>R(, 30 Il>!

:.:(Оаа(!)(>О?1Л т 1 1«"! ПТ . Тгl !Ri 1 .Ttа, 00"Д(. Р ){Ж 11(; Е 11 0 П O! (! К И:, i

3{1888 4 фией нл силпкагепе в системе хлороформ:ме ra(in!I; 25;!-ная гидроокись аммани" (80: 20: 2) .

В у".лзлннай cHcTPV1(>. Iipopx" Tb! фасВ () а, полизя имеют следующую храмятогр;, (1 е скую подвижность: нерасщепивт(ттеся D-фасфлтидилфенолы — Rf = 0,6, cRоб(т,н>>(е кислоты, атп!еттттвтциеся из

1j; ЗГ("2 Пр..IO)KBHHH ),— ())(ос()3гттидттт(())ЕНОЛОВ !

,t = 0, 1 т лизофасфолипиды — Rf = 0,05.

Фссфллипализ заканчивают после

II! -крл щения роста выхаля свободных ж)11 н(тх кислот и лтзо(1)осфолипидов.

Релт(111(он(ту(о,смесь упаривлтот на ро (рн."м -:сплритю е при температуре не

--О С, добыв.!яя 1(еболь((1(е плртии (l)rrp . 1(>;, (,,r)ii o: >,:n -. -:: .(т.;"., .>: (:; rl (r,,>!13(> г(ДЕ>1 г .-- гп(.: (> - (>!r,: : 1 Р )0!ill !" Ä нлтаия (,!1> l 5 мt> i),,:>(.t> orl)01»,>т(>т>1 13 Я> т—

Ват) фа(."il;l "т>»)>Т!.> ")Н" Т (. ". .>.11{("" ат (1p 0",1;.1() (т(,(, в ад, р -,",. -- 1(1 01: во >от п-", -,;отo» i(0(Нст(ЛГ;(т ТЕ){Е,,И Т:. ::--0«1>;., T >(PÑ !

Tr«т-.ü;((i(: 50 С. т)тттт n>1;) С> (Е;гг> гt . >(т> а(татт (т" l,т», >т > К ) OR ф;тст)) 1) .T!Ejllав=i;(H:-, .;,>(и,;;: ) -- 11 ))—

--rlln > г)Л 1 11 т(тг, —,l>.,n !(0! (O Т> C i>,О>(- Н;гт, ., «(П>а{3>а ф01):" гт.> и !) л j >1)т> r; (. .: l)::1>l ().гr:;Clт.;, ioB

iI >агт";"(яlо("(= T)(1 . ". г то" . т.- -:,"-Tor>(= Р!11(тгто

: i )!>1;, 1. (>, !T» l »i. O > Л (ТOJIО,l!(.

1(р(1 Заliо»:. (., .(Тт > ()Л; Т г Ття 11(p 1"1. !г T> сло-", (2-3 мт!) су 101 а ".R)3001(HTR HBT" Рит(> ВНОСЯТ ХЛ>О)РО{1)а(а(11 ЫЙ PЛСТ1300 фОС ())аттт((ттл())еттол(ов. КолаHI ч пра! .. «а(от хлороформам, отделяя нет(рорел гHp авав— шие Вг.— 1 2 (2, 3) -дияцилглице ) oil!>T> затем сист май растворителей хлороформ. метанол 9: 1 (ilo абъе:у) вы; >ывают сумму 1.— и D фосфатидилфенст ав, Чистоту продуктов конгропируют танкаслойН0Н Xp0iIã. T0Bpé(E)HOÉ фарм:мета io!j: 25,>.-.ныя ги раакись ям-! тания 80: 20 . 2 (тта объему) . В этой системе су(13(а 1,— и D-.фосфлтицилфеналав имеет 1 f = 0,6.

)1P 0 JI I3 JI si > T ф а с ф Я т и (: IB! (>) B El o«ë b! Р е Як ти-!

Joan В>1 ськавскаг 0 .т слу7(1>тт Однc"" временно качествент(ОГ(ре Тк:и>ей на фосфор. (т)оct))011HIIоци"-: 1."- Hi ))-тоа(())ЯTHIlилфенолав проводят добавляя к 50- I00 мг фОСфаТ .>ДИПфЕПОЛОГ Б "0 МЛ ДиэтттПОВО го эфира 0,2 мл 0,1 !1 раствора хлористагo кальция и раствор 20 мг яда гюрзь((0)oc IOJIHii:" 1Д B 1 ..-,,Трис-.буфера с р>1 8,0. Полноту гидролиза контролиру(от -анкослайнай храматагра ".:{Я(. 1 л.: у,—;:.1)(я)(1((1 т гиде. Язео гро:((3вт(отга T> ol>) >честны воды. ЗятРм

; Ei 0(.тл> так т(р ат(укт ав (Ъасфалиполизя пас лс дллен:н» iiтзт(тлонаго эфира и воды

Р >CiВOPTr!OT 13 СМЕСИ, СОСтОЯЩЕй ИЗ

О, т» рl xJlopафарl!(1 т 0 5 мп метЯНОла

-:(-:Л-.—.-,—:", T 1 :j>C l;P;ITHI I(0!j ТОНКОСЛОйт; ..;,;. Х>3 (г(Л ТС ГР Лфп Е1 т Па СЛРДОВЯ ТЕЛЬНО цп) .;:: с-:c i cмлх: 1) гексан:дпэтиловый

-..(11!(р (6";:- О по объему), выделяют сво,,-ТД>i!-Л.: НРНЫЕ КИСЛатм, ИМЕЮЩИЕ XPOр;,.-.(ccKук подвижность в этой

-.;- ..(1т!е (К : == О. 6 . 2) хлороформ:метл(! ):11 :!О""-llля гlтдраакись аммония В сас)(;101(те(в!!1 80:20:2 (па абъегл ) . В атой системе выделяют полярные фрак1(тти: лттзсфасфалп иды (Rf = 0,2) и

:.:-рлсщепивотиеся 11-фосфатилилфенолы (Rf =- 0,6) .

Зоны сорбента, содержащие свободные жирные кислоты, с .Ищают и десорбируют несколькими порциями диэтила-, вo! о эфира. Элюат осунают, метилирую,- .- ана.пизир1ют гязажидкостной хромятаграо)ией.

Паласы сйлттклгеля с D-фосфатидил(>)снаттлмтт и с {низафосфалипидами счи; >)(о-. г O RezbE(lle колбы и добавляют как()у(о па 3 мл> 0,5 М метанольного р=ñ-.;òварл гидроокиси калия. Спустя

15 мин к мылам добавляют по 1 мл 1N соляной кислоты и полученные частичНо метилиравлнные жирные кислоты выБО деляют экстракцией петролейным эфира(! (40--60 С) (3 раза по 5 pm).

Смест фттльтруют через фильтр у 4 воронки Шаттл, из приемной колбы пипеткой отбирают в другую колбу слой

55. петропейногс эфира, содержащего жирные кислсты, рлстворитель упаривают, кислоты дометилируют дилзаметяном и анализируют Г)КХ, 1430888

Состав свободных жирных кислот, полученных при расщеплении лизофосфатидилфенолов, не должен отличаться от состава кислот Sn-2-моноацилглицеролов, полученных при липолитиI ческом гидролизе. Совпадение составов подтверждает отсутствие изомеризаций в процессе выделения Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролов и, следовательно, их репрезентативность.

Из двух продуктов фосфолиполиза состав кислот лизофосфатидилфенолов непосредственно отражает набор жирных кислот 1 положения триацилглицеролов.

Набор кислот в Sn-3-положении получают расчетным путем двумя способами: 1) Sn-3-3 (исходные триацилглицеролы) — (лизофосфатиды) — (2-моноацилглицерины), 2) Sn-3-2 (D-фосфатидилфенолы)-(2- моноацилглицеролы).

При выбранных режимах обеспечивается увеличение глубины фосфорилирования, снижение деструкции субстрата фосфорилирования и образование побочных продуктов реакции, уменьшение продолжительности анализа, повышение чистоты выделяемых продуктов фосфо-, липолиза. Избыточное давление кейт- рального газа над реакционной средой, с одной стороны, предотвращает окислительные процессы в- продолжительной реакции фосфорилирования, а с другой, препятствует конденсации влаги в реакционную смесь из газового состава колбы, что улучшает полноту фосфорилирования. Двухстадийный температурный режим фосфорилирования обеспечивает отсутствие побочных продуктов реакции на первой стадии и повьппение глубины на второй стадии. При выходе . за пределы параметров способа точность анализа остается не уровне прототипа.

Пример 1. 0,1 г 1,2 (2,3)-диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатиче ской липазой, фосфорилир свали фенилдихлорфосфатом в токе азота при о. давлении 0,10 MIa температуре — 10 С, выдерживали до завершения реакции о при +5 С в течение 8 ч, Полученные фосфолипйды после фосфолиполиза разделяли тонкослойной хроматографией последовательно в двух системах растворителей гексан:диэтиловый эфир (60:40), хлороформ:метанол:20Х-ная гидроокись аммония (80:20:2).

Из данных, приведенных в табл. 2, 35 видно, что при названных условиях

40 липолиза.

5

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 1), Из результатов, приведенных в табл. 1, видно, что при избыточном давлении в атмосфере азота при снижении температуры в начальный период о фосфорилирования до -!0 С и разделении продуктов фосфолиполиза последовательно в двух системах глубина фосфорилирования увеличивается на 25%, содержание продуктов деструкции-уменьшается на 20%, длительность процесса сокращается на 8 ч и обеспечивается полное разделение продуктов фосфолиполиза.

Пример 2. 0,1 r 1,2(2,3)-диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при о давлении О, 13 МПа, температуре — 11 С о выдержали смесь при +7 С в течение

9 ч до завершения реакции. Продукты фосфолиполиза последовательно разделяли в системах растворителей гексан:диэтиловый эфир (60:40), хлороформ:метанол:20%- ная гидроокись аммония (80:20:2).

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. .") . глубина фосфорилирования увеличивается на 25%, содержание продуктов деструкции снижается на 10Х, длительность процесса фосфорилирования сокращается на 9 ч, обеспечивается абсолютное разделение продуктов фосфо

Пример 3. 0,1 r 1,2(2,3)-диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фе- . нилдихлорфосфатом в токе азота при о давлении 0,15 MIa температуре — 12 С, о выдерживали при +8 С в течение 10 ч до завершения реакции, продукты фосфолиполиза последовательно разделяли в системах растворителей: гексан:диэтиловый эфир (60: 40), хлороформ; метанол:20%-ная гидроокись аммония (80:20:2).

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 3).

35

Из результатов, приведенных в табл, 3 видно, что в данном случае глубина фосфорилирования увеличивается на 257., содержание продуктов дест- 5 рукции снижается на 207, длительность процесса снижается на 8 ч, обеспечивается абсолютное разделение продуктов фосфолиполиза.

Пример 4. О, 1 г 1,2(2,3)-диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при о давлении .0,09 ИПа, температуре -13 С, о выдерживали при 10 С до завершения реакции в течение 7 ч, продукты фосфолипализа последовательно разделяли в системах гексан:диэтиловый эфир (50: 50), хлороформ: метанол (75: 25) .

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 4) .

Из результатов, приведенных в табл. 4, видно, что при осуществлении метода по режимам, выходящим за . оптимальные значения, из поставленных целей достигается только одна — снижение содержания продуктов деструкции, в то время как глубина фосфорилирования, чистота разделения продукта остается на уровне прототипа.

Пример 5. 01 г 12(23)-диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при о давлении 0,20 ИПа, температуре -8 С, выдерживали реакционную смесь при о

+5 С в течение 14 ч, продукты фосфолиполиза последовательно разделяли в системах гексан-диэтиловый эфир (70:30), хлороформ:метанол (85: 15) .

Параллельно проводили эксперимент по режимам, укаэанным в прототипе (табл. 5) .

Из результатов,. приведенных в табл. 5, видно,что при осуществлении метода по режимам, выходящим за границы оптимальных режимом, не достигаются чистота разделения продуктов фосфолиполиза и глубина фосфорилирования.

Формула изобретения

Способ стереоспецифического анализа триацилглицеролов, включающий гидролиз пробы панкреатической липазой, выделение из продуктов гидролиза 2-моноацилглицеролов и смеси

1,2 (2,3)-диацилглицеролов препаративной тонкослойной хроматографией, определение жирно-кислотного состава

2-моноацилглицеролов в 2-положении газожидкостной хроматографией, фосфорилирование смеси 1,2 (2,3)-диацилглицеролов фенилдихлорфосйатом при отрицательных температурах с последующим нагревом до положительных температур и выдержкой в течение нескольких часов, выделение из продуктов реакции смеси L- и Р-фосфатидилфенолов колоночной хроматографи ей, их гидролиз фосфолипазой А, .выделение из продуктов фосфолиполиза

Ь-лизофосфатидилфенолов препаративной тонкослойной хроматографией в системе растворителей хлороформ:метанол, определение их жирно-кислотного состава в 1-положении гаэожидкостной хроматографией и определение жирно-кислотного состава в 3-положенин расчетным путем, о т л и ч а —. ю шийся тем, что, с целью повы- шения точности анализа путем увеличения Глубины фосфорипирования и поо вышения чистоты разделения продуктов фосфолиполиза, фосфорилирование ведут в атмосфере азота под давлением

0,10-0,15 MIIa при температуре (-10)(-12) С и нагрев ведут до температу- ры 5-8 С, при выделении продуктов фосфолиполиза в систему растворителей хлороформ:метанол дополнительно вводят 207-ную гидроокись аммония, а в качестве второй системы растворителей используют гексан и диэтиловый эфир при соотношении растворителей

80:20:2 и 60:40 по объему соответственно.

1430888

Показатели

Способ

90

25 i0

70-80

100

Способ

Показатели

Прототип

18

100

Глубина фосфорилирования, X от суммы диацилглицеролов

Содержание продуктов деструкции„

Длительность процесса фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, X

Глубина фосфорилирования, Ж от суммы диацилглицеролов

Содержание продуктов деструкции, 7.

Длительность процесса фосфорилир ования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, X

Т а бл и ц а 1

Прототип Предлагаемый при

P=O, 1 МПа, — — 10 С t=-+5 С

Таблица2

Предлагаемый при

P = 0,13 МПа, о — — 11 С

+7 С

1430888

Способ

Показатели

Прототип

90. 65

18. 10

100

Способ

Показатели рототип

65

25

70

Глубина фосфорилирования, 7. от суммы диацилглицеролов

Содержание пр одуктов деструкции, 7

Длительность процесса фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, 7.

Глубина фосфорнлирования, 7 от суммы диацилглицеролов

Содержание продуктов деструкции, 7.

Длительность процесса фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, 7

12

Таблица 3

Предлагаемый при

P = 0,15 ИПа

=-12 С

+8 С

Таблица 4

Предлагаемый при

P = 0,09 ИПа

t -=-13С

t =+10 С

1 430888

14

Т а бл и ц а 5

Показатели

Способ

Предлагаемый при

P = 0,2 ИПа

-8 С

+5 С

Прототип

Глубина фосфорилирования, % от суммы диацилглицеролов 65

Содержание продуктов деструкции, %

Длительность процессов фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, %

70

Составитель В.Гордеев

Техред Л.Сердюкова КорректоР М.Васильева

Редактор М.Циткина

Тираж 847

Заказ 5338/47

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1f3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 а