Способ определения плазминогена в эуглобулиновой фракции крови
Изобретеше относится к гематологнн. Цель изобретения - повышение специфичности и точности способа. В i Кювету спектрофотометра вносят раствор фибриногена и эуглобулиновую фракцию плазмы крови, инкубируют и добавляют тро.мбин, бьгчий сьшороточньш альбумин и стрептокиназу. После добавле шя qмecи-регистрируют изменение светопропусканий. Затем определяют тангенс угла наклона кривой, отражающей процесс лизиса фибрина. По калибровочному графику рассчитьшают содержание плазминогена в пробе.3 ил. 1 табл. с
СООЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ . РЕСПУБЛИН. А1 (19) (И) (б)) 4 G Oi И 33/48
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 4035126/28-14 (22) 12, 03, 86 (46) 07.11„88. Бюл. Р 41 (71} Всесоюзный кардиологический научный центр (72) Е.В,Титаева, A.Á.Äoápoâîëüñêèé и В,Н.Титов (53) 612,015(088.8) (56) Kohn S. Sakurama S. Morioka Т., Ito Y., Yasukouchi T., Nakagava S. ,Thromb.. IIaemostas, v. 42, рр. 126 1в
1275, 1979. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА
В ЭУГЛОБУЛИНОВОЙ ФРАКЦИИ КРОВИ (57) Изобретение относится к гематологии. Цель изобретения - повышение специфичности и точности способа, В
1 ювету спектрофотометра вносят раст1 вор фибриногена и зуглобулиновую фракцию плазмы крови, инкубируют и добавляют тромбин, бычий сывороточEIbd> альбумин и стрептокиназу. После добавления смеси регистрируют изменение светопропусканий. Затем определяют тангенс угла наклона кривой, отражающей процесс лизиса фибрина, По калибровочному графику рассчитывают содержание плазминогена в пробе.3 ил.
1 табл.
1436073
Изобретение относится к медицине, а именно к области коагулологии, изучающей гемостаз и Фибринолиз.
Целью изобретения является иовы5 шение специфичности и точности способа.
- На Фиг. 1 показан график измене-. ния светопропус*ания при 500 нм в процессе образования и последующего лизиса Фибринового сгустка (где слева направо представлены кривые хода реакции, полученные лри добавлении
50, 40, 30, 20 и 10 мкл эуглобулино вой.фракции стандартной плазмы, ско- 15 рость лизиса Фибрина (ЬТЖ/gt мин) !.определяли по тангенсу угла наклона ! прямолинейного участка), на Фиг. 2калибровочный график для определения содержания ппазминогена по скорости 20 лизиса Фибрина (зависимость описыва ется уравнением Y = -3,28+0,32Х, где
Г = 0,99), на Фиг. 3 — график срав -: .нения результатов определения содер-. жания плазминогена амидолитическим 25 (ocr. ординат) и предлагаемым (ось абсцисса) методами (зависимость опи-. сываетея уравнением 7 22,б8ФО 76Х,, .Г2 = 0991), Способ осуществляют следующим об- 30 разом.
Из цитратной плазмы осаждают эуглобулиновую фракцию. Затем вносят ее в кювету спектрофотаметра, содержащую .стандартный раствор Фибриногена свободного от нлазминогена, Реакц7ио за«-.
1тускают добавлением смеси тромбина со стрептокиназой, стабилизированной бычьим сывораточным альбумином, и .регистрируют изменения светопропускания нри 5ÎÎ нм, происходящее при образовании и последующем лизисе Фибри нового сгустка. Скорость лизиса, оп ределяемая по линейному участку кривой, отражающей процесс .лизиса сгуст-45 ка, .прямо пропорциональна количеству, плазминогена в пробе (Фиг. 1). Опреде.лив скорость лизиса, находят соответ" ствующее значение содержания плазмнногена по калибровочному графику, построенному с использованием зуглобули новой Фракции стандартной плазмы.
В предлагаемом способе количество плазминогена определяется по активности образующегося плазмина, а не комплекса стрептокиназа — плазминоген., Оптимальное количество стрептокиназы, необходимое для активации плазминогена в предлагаемом методе, находится в пределах 15-25 Е íà 0 05 мп эуглобулиновой Фракции. При добавле" нии больших количеств стрептокиназы скорость лизиса фибрина уменьшается.
График зависимости скорости лизиса от количества добавленной эуглобулиновой фракции стандартной плазмы (фиг. 2) пересекается с осью абсцисс в точке, соответствующей 5 мкл эуглобулиновой фракции стандартной плазмы.
Из этого следует.„что при, добавлении
20 Б стрептокиназы 10Х нлазминогена стандартной плазмы уходит на образование активаторного комплекса. При добавлении избытка стрептокиназы боль.. шее количество стрептокиназы уходит на образование активаторного комплекса и, соответственно, меньшее количе-. ство превращается в плазмин. Скорость лизиса уменьшается. Использование меньших количеств стрел оиназы нежелательно, так как в крови обычно присутствуют антитела к белкам стрептококков, которые могут нейтрализовать некоторое количество стрепктокиназы.
Дпя выполнения первого определе-ния требуется 1 ч 30 мин на получение эуглобулиновой Фракции и 10-30 мин на постановку реак Ия. Время протека-" ния реакции зависит от содержания плазминогена в пробе. При 100K реакция завершается за 5 мин, а при содержании плазииногена 20Х требуется около 20 мин. Образцы плазмы можно . ,о хранить при -20 С в течение месяца.
Эуглобулиновые фракцйи хранили nprr
4 С и использовали в течение суток. о
Hp и гл е р 1. К 4 мп дистиллированной воды добавили 75 мкл 13-йой уксусной кислоты и 0,25 MI исследуе-. мой плазмы. После инкубации в тече ние 20 мин при А С центрифугировали
5 мин при 1500 об/мин. Осадок раот,ворили в 0,25 мп боратно-солевого раствора {13,5 мИ Na 37 С, затем добавляли 50 мкл смеси, содержащей на 1 мл 1,5 мг тромбина (1(аунасс), 5 мг бычьего сывороточного альбумина (Sigma) и 400 Е стрепто киназы (Calbiochem), приготовленной на 0,15 М Трис-НСУ буфере, рН ?,.2. Через 30 с после добавления смеси Способ определения плазминогена в эуглобулиновой фракции крови, вклю35 чающий активацию его стрептокиназой, добавление в пробу лизируемого субстрата с последующей регистрацией скорости лизиса по изменению светопропускания и расчетом по калибровочно40 му графику, о г л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности и точности способа, в качестве субстрата используют избыток фибрина а стрептокиназу добавляют в количе45 стве, обеспечивающем выход кривой лнзиса на линейный участок с изменения ми не менее 2,5% светопропускания в минуту. Способ 0 52 4 ° 50 7>58 4г57 6е58 Зэ54 6 ° 52 4ю54 Оэ58 2э55 7 3 э2 Предяага 9,1 38,0 41,4 44,1 37,6 45,7 44,5 43,2 . 41,7>3,1 Известный 44,9П,3 56,8 58, 7 3 14360 включали регистрацию изменений светопропускания. После завершения реакции определяли тангенс угла наклона кривой, от5 ражающей процесс лизиса фибрина. Содержание плазминогена в пробе определяли по калибровочному графику (фиг. 2). При низком содержании плазминогена в пробе (+ 20X) для повыше- 10 ния точности определения целесообразно использовать 100 мкл эуглобулиновой фракции и 350 мкл раствора фибриногена, а содержание плазминогена, определенное из графика (фиг. 2), разделить на 2. На фиг. 3 представлены данные 30 определений содержания плазгжногена, выполненных по известному способу с использованием фромогенного субст- 20 4 рата Berichrom P1 фирмы Behringverke (ордината) и по предлагаемому спосо- бу (абсцисса). Использовали кровь доноров и больных, не страдающих тромбозами (содержание плазминогена 25 3 75%) и кровь больных после лечения стрептокиназой (плазминоген < 70%) . Применение метода линейной регрессии 1 для анализа данных показало, что зависимость между величинами, получен- 30 ными этими двумя способами, описывается уравнением прямой Y = 0,76Х + + 22,68, коэффициент корреляции r = = 0,91. Пересечение прямой с осью ординат в точке, соответствующей .22,68, хорошо согласуется с данными о завышении истинного содержания плазминогена при определении его по амидолитической активности при некоторых патологиях. Разница в 10-20Х становится особенно выраженной при низкой концентрации плазминогена, обусловленной потреблением этого белка в ходе фибринолитической терапии. Кроме того, повышенная концентрация продуктов деградации фибриногена, .как результат активации фибринолиза, создает еще один источник ошибок при„ 73 4 использовании известного способа в этом случае (таблица) . С целью сравнения точности был приготовлен раствор плазминогена с концентрацией белка 0,1 мг/мл и проведено 10 параллельных определений по предлагаемому и известному способам. Причем в двух последних определениях к реакционной смеси добавили фибриноген до конечной концентрации 1мг/мл. Этим моделируют одно из патологических состояний, когда известный способ дает завышенные величины. Из данных таблицы следует точность предлагаемого и известного способов примерно одинакова при параллельных измерениях сдного и того же образца. Но амидолитическая активность комплекса стрептокиназа-плазминоген существенно потенциируется фибриногеном (пробы 9 и 10), что приводит к появлению систематической ошибки в определении по известному способу. Если сравнивать данные всех 10-ти определений, можно говорить о повышении точности при использовании предлагаемого способа, которое обусловлено устранением систематической ошибки, Формула и,зобретения f436073 Т436073 25 50 75 ТО 1О 4 Риа Я Составитель А.Агуреев Редактор А.Шандор Техред и.дидык Корректор М.Васильева Заказ 5643/46 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий ll3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
