Способ определения целостности ядер в срезах биологической ткани на цитологическом препарате

 

Изобретение относится к биологии , в частности к цитологии и касается идентификации целостности ядер в срезе Преимущественно изобретение предназначается для определения размеров ядер и фитофотометрического исследования ДНК ядер в срезах . Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение за счет идентификации целостности ядра. Для этого отбирают пробу исследуемой ткани, фиксируют ее, обезвоживают , заключают в парафин, готовят микротомные среяы, окрашивают их по Фельгену, а затем микроскопируют в фазовом контрасте и по зеленому цвету ядра судят о его целостности. а W

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (д1) 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fKHT СССР (21) 4100766/28-13 (22) 29а05.86 (46) 15.01.89. Бюл. М 2 (71) Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (72) Б. М. Андр осов а (53) 576. 3 (088. 8) (56) Хесин Я.Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток, М.: Медицина, 1967, с. 7-33.

Хруст I0.P. и др. Основы количест венной цитохимии, Изд. Моск. универ ситета, 1978, с. 13-18, 31-33. ,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ

ЯДЕР Б СРЕЗАХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ (57) Изобретение относится к биологии, в частности к цитологии и касается идентификации целостности ядер в срезе. Преимущественно изобретение предназначается для определений размеров ядер и фитофотометрического исследования ДНК ядер в срезах. Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение за счет идентификации целостности ядра. Для этого отбирают пробу исследуемой ткани, фиксируют ее, обезвоживают, заключают в парафин, готовят микротомные срезы, окрашивают их по Фельгену, а затем микроскопируют в фазовом контрасте и по зеленому цвету ядра судят о его целостности.

1451598

Изобретение относится к биологии, в частности к цитологии и касается идентификации целостности ядер в срезах биологической ткани. Преиму5 щественно изобретение предназначается для определения размеров ядер и цитофотометрического исследования

ДНК ядер в срезах.

Целью изобретения является повыше- 10 ние точности способа и его упрощение за счет идентификации целостности ядра.

Способ иллюстрируется следуницими пример ами. !5

Пример 1. Кусочки листьев проростков гш еницы сортов Эммер и

Баплади 116 фиксируют по Карнуа, после чего их обеэвоживают, заключают в парафин и приготавливают срезы тол- 2р щиной 10 мкм общепринятым методом.

Депарафинированные срезы окрашивают по Фельгену и просматривают под микроскопом ЛЮМАМ-И-1 в проходящем свете от лампы накаливания, Все ядра 25 имеют одинаковый цвет — сиреневокрасный. При просмотре этих же ядер в фазовом контрасте одни иэ них имеют зеленый цвет, другие — желтый и оранжево-желтый. Применение других кис- 30 лых и нейтральных фиксаторов, обычно .применяемых для исследования ДНК ядер посредством реакции Фельгена, на результат не влияет, Методом послойной реконструкции удалось установить, что зеленый цвет имеют целые ядра, а желтый или оранжевый — резаные. Из 87 ядер идентифи-: цируют 35 как целые и 52 как резаные.

Для доказательства установленного явления применяют еще два методических подхода.

Из мезофилла листьев проростка пшеницы выделяют протопласты, где все ядра заведомо целые. После окрас-45 ки по Фельгену выделенных протопластов в суспензии и приготовления мазков препараты просматривают под микроскопом. В проходящем свете все ядра в мазках, как и в срезах, имеют сир енево-кр асный свет, а в фазовом контрасте все ядра зеленые.

Так как в мазке все ядра заведомо целые, то зто подтверждает связь зеленого цвета ядра в фазовом контрасте с его целостностью.

При помощи винтового окуляр-микрометра в мазках устанавливают средние размеры ядер киеток мезофилла листьев пшеницы. Максимальный диаметр ядра:

11,50 + 3,80, минимальный 5,40 + 0,01, При используемой толщине среза (10 мкм) ядро такой величины можно разрезать только на две части. Очевидно, что в этом случае средние размеры резаных ядер меньше средних размеров целых. На поперечных срезах листьев пшеницы, нспользуя предлагаемый способ, при помощи винтового окуляр-микрометра производят измерение целых и отдельно резаных ядер (P =

99 ). Средние размеры целого ядра (9,41 «10,48) оказ апись больше, чем резаного (7,96«9,21).

Данные, полученные в эксперименте, служат основанием для исследования изменения количества лабильной

ДНК и размеров ядер в листьях проростков пшеницы, пораженных возбудителем стеблевой ржавчины.

Пример 2, Свежую печень белой крысы помещают в 10%-ный формалин при о

4 С, измельчают на кусочки объемом

6 мм, постфиксируют в смеси зтанол з ледяная уксусная кислота в соотношении 3: 1 в течение 2 ч. Затем обезвоживают, заключают в парафин и приготавливают срезы толщиной IO u

5 мкм общепринятым методом. Депарафинированные срезы окрашивают по

Фельгену и просматривают под микроскопом ЛЮМАМ-И-1 в проходящем свете от лампы накаливания. Все ядра имеют одинаковый цвет — сиренево-красный. Цитоплазма окрашена в розовый цвет. При просмотре этих же ядер в фазовом контрасте большинство из них зеленого цвета, меньшая часть желтого. Цитоппазма видоизменяется, приобретая бледно-желтый оттенок, что не мешает четко различать ядра как целые, так и резаные.

Для доказательства того, что зеленый цвет в фазовом контрасте в срезах печени так же, как и в листьях пшеницы, имеют целые ядра, окрашивают ядра по Фельгену непосредственно в целом кусочке печени и затем из этого кусочка готовят давленый препарат, где ядра заведомо целые. В таком цитологическом препарате под микроскопом в проходящем с в ет е все ядра имеют один цвет — снреневокрасный, а цитоппазма — розовый. В фазовом контрасте ядра зеленого цвета, а цитоплазма по-пр.:к нему розового.

Со ст авит ель И. Т ар е ев а

Техред А. Кравчук

Корректор М.Демчик

Редактор Л. Веселовская

Заказ 7073/42 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета iso изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 1451598 а

Для доказательства того,что реза- печени в фазовом контрасте имеют желные ядра в срезах печени в фазовом тый цвет, контрасте имеют желтый цвет, опреде- ф о р м у л а и s о б р е т е н и я ляют число резаных ядер в срезах тол5

Способ определения целостности щнной 10 и 5 мкм. Очевидно, что в бо- ядер в срезах биологической ткани лее тонком срезе должно быть больше на цитологическом препарате, включарезаных ядер, следовательно, в фазо- наций отбор пробы ткани, фиксацию, вом контрасте большинство ядер имеет обезвоживание и заключение ее в пажелтый цвет. Число зеленых и желтых 0 рафин, приготовление мнкротомных ядер определяют при помощи 12-клавиш-- срезов, их окрашивание bio Фельгену ного счетчика по препарату, выбирая с последукщим определением под светонесколько случайных попей зрения, В вым микроскопом, о т л и ч а ю щ и йпяти полях зрения срезов толщиной с я тем, что, с целью повышения точ10 мкм в среднем оказалось 24,5 жел- 15 ности способа и его упрощения за тых ядер, а в срезах толщиной 5 мкм — счет идентификации целостности ядра .41,8. Таким образом, уменьшение тол- непосредственно в одном срезе, опрещины среза в 2 раза примерно во столь- деление ведут в фазовом контрасте и ко же раз увеличило число резаных по зеленому цвету ядра судят о его ! ядер. Следовательно, рез аные ядра . 20 целостности.