Способ определения содержания кронетона в сыворотке крови

 

Изобретение относится к биохимии . Пробы обрабатьшают этиловым спиртом нри соотношении 1:9 и центрифугируют . Измеряют спектр фотолюминесценции супернатанта. Сравнивают спектры контрольной и опытной проб и проводят двойное нормирование по интенсивности излучения. Количество кронетона находят по калибровочной кривой. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (59 g С 01 N 33/49

ВьГАИЗМ

ПЗЛЕНТвй 1- :::.. " - 11

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А BTOPCHOMV (:ВМДЕТЕЛЬСТВУ

БОБР "i :

ГОсудАРстВенный номитет

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИ ЯМ

ПРИ ГНКТ СССР (21) 4205760/28-14 (22) 16.04.87 (46) 07.03.89. Бюл. Ф 9 (71) Московский научно-исследовательский институт гигиены им: Ф.Ф.Эрисмана (72) И .Л.Грицевская, М.А.Ильин, В.Я.Коварский и В.В.Некрасов (53) 6 12.015(088 ° 8) Изобретение относится к экспериментальной токсикологии, а именно к количественному определению содержания пестицида кронетона в сыворотке крови лабораторных животных.

Цель изобретения — создание селективного способа определения кронетона в сыворотке крови.

Цель достигается путем извлечения кронетона из сыворотки, осаждения белков сыворотки, центрифугирования, записи спектра люминесценции надосадочной жидкости, последующей обработки полученного спектра и сравнения полученных результатов с зара нее построенной градуировочной кривой.

Оптимальные условия фотолюминесценции кронетсна в растворителе— о

96 -ном этаноле: максимум испускания наблюдается при = 310 нм, если 3 возбуждающего света 235 нм. Сывор отка крови жив от ных, о бра ботанная о

96 -ным этанолом (T, е., надосадочная

„.SU,» 3464084 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

KPOHFT0HA В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Из о бр ет ение относится к биохимии. Пробы обрабатывают этиловым спиртом при соотношении 1:9 и центрифугируют. Измеряют спектр фотолюминесценции супернатанта. Сравнивают спектры контрольной и опытной проб и проводят двойное нормирование по интенсивности излучения. Количество кронетона находят по калибровочной кривой. 3 табл. жидкость после осаждения белков этанолом и центрифугирования), дает . максимум фотолюминесценции на уровне

340 нм при Ь возбуждающего света

235 нм, т.е. в другой спектральной области. Сыворотка крови животных, содержащая кронетон, обработанная добавлением этанола, дает сложный спектр с максимумом фотолюминесценции на уровне 340 нм и сильным дополнительным (по сравнению со спектром с ывор отки кр ови без кр онет она) све.ением в области 300-320 нм при Л возбуждающего света 235 нм, т.е. данный спектр представляет собой суперпозигдю спектров фотолюминесценции сыворотки крови и кронетона, где вклад в коротковолновой части спектра дает люминесценцию самого кронетона .

Принцип обработки полученных спектров состоит в определении величины $, пропорциональной площади между . нормированными спектрами фотолюми1464084

S несценции сыворотки крови с кронетоном и без него в ойтасти Л = 300320 нм. Определение содержания кронетона N в сыворотке крови по измеренным спектрам фотолюминесценции производится следующим образом: при значениях Л = 300, 305, 310, 315, 320 нм определяют значение функции

I,/Л/ и

q/Л/ = — — — --1

I / / где I, /Л / — значение интенсивности фотолюминесценции в пробе сыворотки крови, содержащей кронетон", I /Л / — значение и нт енсивнос ти фотолюминесценции в пробе сыворотки без кронет она; и — коэффициент, получаемый при делении максимального значения интенсивности фотолюминесценции сыворотки крови (при Л =

340 нм) на максимальное значение интенсивности фотолюминесценции образца сыворотки крови, содержащей кронетон (при

А = 340 нм).

Величина g/Л / определяет при каж-! дом фиксированном значении Ь нормированную разность интенсивностей спектров фотолюминесценции сыворотки с кронетоном и беэ него.

Затем находят величину S: S =tP 300 нм + 2 М 305 нм +2 g 310 нм +

+2 tg 315 нм + ц"320 нм, а по ней определяют значение Б (содержание кронетона), используя заранее построенную градуировочную кривую )М/S

N/S/ = 1,8 10 S, Я) -= моль/л.

При построении градуировочной зависимости использованы результаты независимых измерений 54 модельных смесей растворов кронетона с известной концентрацией и сыворотки крови.

Метрологическая характеристика способа. Воспроизводимость оценивается величинами стандартного (S) и относительного стандартного отклонения (S „), расчитанными по формулам

S

Я х

IIpKBHëüíoñòü оценивается по величине погрешности единичного измере-.

BN ния — = 807.. Диапазон концентраций

N кронетона, определяемых предлагаемым способом, 10 — 10 моль/л (0,002250,225 г/л) . Результаты проведенных измерений удовлетворяют статистическому критерию содержательности

cont. 26 7 4F P„, =15, характеризующему надежность или предсказательность модели.

Средние значения (по результатам независимых измерений) для смесей кронетона с сывороткой крови при различном содержании препарата приведены в табл. 1.

Опытным путем установлено оптимальное соотношение сыворотки крови и этанола 1:9. Прибавление меньшего количества спирта (1: 7, 1: 5) не полностью осаждает белки и надосадочная жидкость остается мутной, большая доля этанола приводит к черезмерному разбавлению вещества. Результаты измерений (табл. 2) S u N (N — концентрация кронетона в модельной смеси, в данном случае равна 10 Э М/л) показывают, что применение соотношения сыворотки и спирта 1:8, 1:9, 1:10 дает близкие результаты, а отношение 1:7 и 1:11 вызывает большую погрешность измерений.

Пример 1. Белой крысе массой 200 r внутрижелудочно вводят кронетон в количестве 60 мг (доза

300 мг/кг). Через 15 мин у животного берут 1,5-2 мп крови и центрифугируют для отделения сыворотки. 3атем отбирают пипеткой 0,5 мл сыворотки крови, помещают в центрифужную пробирку, добавляют 96 -ный этанол до объема 5 мг, встряхивают для экстракцни кронетона спиртом и удаляют осажденные белки центрифугированием в течение 15 мин (скорость

1500 об/мин) . Далее измеряют спектр фотолюминесценции прн Л возбуждающего света 235 нм (в данном случае используют флуоресцентный спектрофотометр марки МРГ-44 Penh inWlmer, измерения проводят при размере целей

3 и 8, усилении 3) . Аналогично обрабатывают кровь от интактного животного, не получившего кронетон, и измеряют спектр фотолюминесценции на1464084 досадочной жидкости при Л возбуждающего света 235 нм. Данный спектр служит внутренним люминесцирующим стандартом при определении концентра5 ции кронетона в опытной пробе.

Далее проводят двойное нормирование по интенсивности излучения в целях преодоления разброса показателей. Определяют коэффициент и путем деления интенсивности фотолюминесценции в максимуме полосы контрольной пробы (при Л = 340 нм) на интенсивность фотолюминесценции в максимуме полосы опытной пробы (также при

Л = 340 нм):

Затем находят величину S по формуле. S = М 300 нм +2 Ц 305 нм+

+2Ц 3!0 нм +2 4 315 нм + Lp 320 нм, т.е. 1,6+11,6 +26,8 +26,92 +6,3

67, 22, Пользуясь градуировочной зависимостью N от S находят, что концентрация кронетона в опытной пробе составляет 1, 5 .10 моль/л. Учитывая, что сыворотка крови разбавлена в

10 раз, концентрация кронетона в сыворотке крови равна 1,5 10 моль/л (М.в. кронетона =225, 1,5.10 4 моль/л=

=0,034 г/л или мг/мп) .

Фор мула из о бр ет ения

13 8 и = — - — = 265.

5,2

Способ определения содержания кронетона в сыворотке крови, включающий обработку пробы этиловым спиртом при объемном соотношении проба:спирт 1:9, отделение осадка с последующими измерением фотолюминесценции супернатанта, обработкой спектра в сравнении с таковым в контрольной сыворотке, определением площади пика в области длин волн 300-340 нм и расчетом количества кронетона по калибровочной кривой.

Пользуясь формулой

20 численный множитель 100 вводят для удобства вычислений), находят EP/Я / при значениях Л 300,305,310,315 и

320 нм, т.е. в области, где наибольший вклад дает фотолюминесценция самого кронетона. Данные приведены в табл. 3.

30

Таблица 1

Концентрация кронето- Площадь, S/3 /, на в пробе N моль/л усл. ед.

Стандартное Относительотклонение,S ное стандартное отклонение, S>

Та блица 2

Соотношение сы18 1 9 1:10 t!1t

801 824 796 712

1:7

705 воротки и этанола

Площадь, S, усл. ед.

qÐ/ = — — — — -1 100, t Z /Ë/ и

1 ° 10 >

2,5 -10

5-10

7,5 -10

1 -10

5 .10-4

5 -10

7,5 -10 4 .10-3

117

181

207

213

338

569

673

767

20,7

152

66,18

178, 16

178,16

265, 7

314,8

568

104

0,51

1,28

0,36

0,836.

0,836

0,78

О, 543

0,84

0,13

1464084

Та блица 3 опыт мм

Л, н/м

I>, контроль, мм

Составитель В. Митюшин

Редактор И. Горная Техред М.Дидык Корректор Н. Король

Заказ 819/48 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

320

37,1

50,3

67,5

83,4

97,6

36,5

47,5

59,5

75,5

9i 0

1,6

5,8

13,4

10,46

6,3