Способ получения иммобилизованной формиатдегидрогеназы

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации формиатдегидрогеназы.Цель изобретения - повышение выхода иммобилизованной формиатдегидрогеназы по активности. Способ заключается в иммобилизации фермента на носителе, предварительно обработанном глутаровым альдегидом. Иммобилизацию, проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и конкурентных по формиату ингибиторов фермента. Молярное соотношение фермента и НАД 1:(2-215)

концентрация ингибитора равна 12,3-1430 константам ингибирования. Для увеличения стабильности иммобилизованную формиатдегидрогеназу обрабатывают боргидридом натрия. Выход фермента возрастает с 27 до 56-77%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„14795 f 4 (51) 4 С 12 N 11/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

J з, /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4?72103/31 — 13 (.22) 30.0/.87 (46) 15.05.89. Бюл. № 18 (71). Институт биохимии им. А.Н.Баха, МГУ им. M.B.Ëoìoíîñoâà и Научно1! производственное объединение Фермент (72) И.В.Березин, P.К.Вайткявичюс, А.-С.А.Глемжа, В.В.Дайниченко, А.М.Егоров, В.О.Попов, С.Л.Пундис и В.И.Тишков (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1326616, кл. С 12 N 11/00, 1985.

Родионов Ю.В. и др. НАД вЂ” зависи— мая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий. Изучение свойств и стабильности растворимого и иммобилизованного ферментов. — Биохимия, 1977-, т. 42, № 11, с. 2020-?026.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения иммобилизованной формиатдегидрогеназы, в частности формиатгидрогеназы метилотрофных микроорганизмов, которая может быть использована как составная часть системы регенерации кофактора в различных областях биотехнологии — тонком органическом синтезе, анализе, медицинской диагностике.

Цель изобретения — повышение выхода иммобилизованной формиатдегидрогенаэы по ферментативной активности. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИОБИЛИЗОВАН -

НОЙ ФОРМИАТДГГИДРОГЕНАЗБ1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации формиатдегидрогеназы. Цель изобретения — повышение выхода иммобилиэованной формиатдегидрогеназы по активности. Способ заключается в иммобилизации фермента на носителе, предварительно обработанном глутаровым альдегидом. Иммобилизацию проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и конкурентных по формиату ингибиторов фермента. Молярное соотношение фермента и НАД 1:(2-215), концентрация ингибитора равна 12, 3-1430 константам ингибирования. Для увеличения стабильности иммобилизованную формиатдегидрогеназу обрабатывают боргидридом натрия. Выход фермента возрастает с ?7 до 56-777,.

Способ заключается в том, что при инкубации фермента с нерастворимым аминированным носителем, активированным глутаровым альдегидом, в инкубационную смесь дополнительно вводят кофактор фермента и конкурентные по отношению к формиату ингибиторы фермента. Соотношение фермент — никотинамидадениндинуклеотид окисленнный устанавливают 1:2-215, а ингибитор добавляют в концентрации, равной

21,3-1430 константам ингибирования.

Выход целевого продукта по активности возрастает при этом от ?7 + 51 до

55 — 773. з 14795

Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.

Пример 1. 250 Mr аминирован ного силохрома С-800/70 инкубируют в 7 мл дистиллированной воды при

90 С в течение 30 мин. Далее силохром промывают 50 мл 0,1 M калий-фосфатного буфера, рН 7,0 и инкубируют при постоянном перемешивании с 10 мл

2,5 -ного раствора глутарового диальдегида в том же буфе1 е. Обработанный альдегидом силохром отмывают от несвяэавшегося глутарового альдегида на стеклянном Фильтре 500 мл О, 1 М фосфатного буфера, рН 7,8 и 50 мл

0,1 M фосфатного буфера рН 7,0. К отмытому силохрому добавляют 3 мл раствора формиатдегидрогеназы (О, 5 мг/мл, 6, 2 ° 10 М) в С, 1 М фосфатном буфере, рН 7,0, 0,4 мл НАД (1Г MM) и 100 мкл раствора аэида натрия (6,5 ° 10 4 М, К;, 10 M) (молярное соотношение фермент — НАД --азид составляет 1:215) и инкубируют при постоянном перемешивании в течение

3 ч при 25 С. Несвязавшийся фермент смывают 40 мл раствора 3 М формиата в О, 1 М фосфатном буфере, рН 7, 8.

В результате иммобилизации к силохрому присоединяется 80 белка, .которые сохраняют 60 активности.

Пример 2. Иммобилизацию формиатдегидрогенаэы проводят согласно примеру 1. Полученный катализатор о обрабатывают при охлаждении,(4 С). 35

3 мл раствора боргидрида натрия (10 мг/мл) в О,? М фосфатном буфере, рН 7,8. Удельная активность иммобили— эованной формиатдегидрогеназы после обработки боргидридом не изменяется.

Обработка боргидридом приводит к повьппению стабильности иммобилиэованных ферментных препаратов при пониженных (7,0) значениях рН. При хранении иммобилиэованной формиатде- 45 гидрогенаэы, полученной согласно примеру 1, в буферном растворе с рН

7,0 в течение 4 мес, при 4 С наблюдается десорбция до 30 белка. Для препаратов иммобилиэованного фермен- 50 та, обработанных боргидридом натрия, в тех же условиях весь белок остается связанным с сорбентом.

Пример 3. Осуществляют по примеру 1, но вместо азида натрия 55. берут ?О мкл раствора нитрита натрия (0,1 М, 1, 4,5 ° 1С 4 М). В результате при иммобилизации концентрация ингибитора составляет 12,3 К, а к

14 силохрому присоединяется 83 белка, который сохраняет 55 активности.

Пример 4. Способ осуществля ют по примеру 1, но НАД добавляют в концентрации 1, 1 10" М, а 100 мкл аэнда натрия берут из раствора в концентрации 5 1С М (соотношение фермент-НАД составляет 1:20, концентрация ингибитора 1430 2 К;). В результате иммобилизации к силохрому присоединяется 80Х белка, которые сохраняют 56 активности.

Пример 5. Отличающийся от примера 1 тем, что в качестве сорбента используют аминогексилсефарозу, 2 r носителя инкубируют в течение

4 ч в 50 мл 2,5Х-ного водного раство" ра глутарового альдегида при 20 С.

Далее носитель отмывают на фильтре

О, 5 л 3 М КС1, О, 5 л дистиллирован- . ной воды и 0,5 л 0,2 M К-фосфатного буфера, рН 7,0. Затем модифицированный носитель инкубируют с раствором формиатдегидрогенаэы (4 мл. 1 мгlмл) в 0,2 M К-фосфатном. буфере, рН 7,0 при встряхивании на качалке в течение 3 ч при 25 С. Иммобилизацию проводят в присутствии НАД (2 мМ) и азида натрия (10 M). Молярное соотношение фермент — НАД равно 1:164, а концентрация ингибитора 1000 К;.

По окончании процесса иммобилизации носитель отмывают на фильтре

100 мл 3 M НС1, 100 мл 3 M формиата натрия, 0,5 л 0,2 M К-фосфатного буфера, рН 7,0. В результате при иммобилизации сохраняется 77 . Ферментативной активности.

П р:и м е р 6. Способ осуществляют по примеру 3, но концентрация нитрита в реакционной смеси составляет

0,2 M (444 К;). К силохрому присоединяется 86Х белка, который сохраняет 60Х активности.

Пример 7. Способ осуществляют по примеру 6, но иммобилиэацию проводят в присутствии 1,5 М хлорида натрия. К носителю присоединяется

87 белка, который сохраняет 58 . активности

Пример 8. Способ осуществляют по примеру 1, но вместо азида используют роданид в концентрации

6 ° 10 М (К; = 1,1 i 1С М, концентрация = 55 К;). К носителю присоединяется 90 фермента, который сохраняет 57 активности.

14795 ляет получать биоорганические катализаторы на основе фармиатдегидрогеназы, обладающие высокой активностью, и приводит к уменьшению расхода фермента. Восстановление лабильной азометиновой связи боргидридом препятствует десорбции фермента с носителя в процессе эксплуатации и повышает его операционную стабиль" ность.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Составитель В.Муронец

Техред M,Õîäàíè÷

Корректор А.Обручар

Редактор M.Íåäoëóæåíêo

Заказ 2504/25 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101

11 р и м е р 9. Способ осуществляют по примеру 1, но вместо азида используют цианат натрия (К = 2 х 10 М) в концентрации 2 10- M (100 К;). К силохрому присоединяется

85г фермента, который сохраняет

607 активности.

Пример 10. Способ осуществляют по примеру 1, но концентрация

10 формиатдегидрогенаэы в растворе составляет 5 мг/л (6,2 10 M), НАД 1,2 1О «М, азид 5 10 M (соотношение фермент — НАД 1:2).Концентрация ингибитора равна 500 К..

К силохрому присоединяется 771 фермента, который сохраняет 587 активности.

Пример 11. Способ осуществляют по примеру 1, но концентрация формиатдегидрогеназы в растворе составляет 5 мг/мл, концентрация

НАД 10 М, азида 1,4 . 10-4М (соотношение концентраций фермент -НАД

1: 16, концентрация ингибитора

1400 K;); К силохрому присоединяется

80 фермента, который сохраняет 567 активности.

Преимущество предлагаемого способа иммобилизации формиатдегидрогеназы заключается в том, что благодаря 0 присутствию в реакционной смеси специфических защитных агентов процесс иммобилизации протекает с минимальными потерями активности, что позвоСпособ получения иммобилиэованной формиатдегидрогеназы, включающий инкубирование фермента в буферном растворе с нерастворимым аминированным носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, и отмывание носителя от несвяэавшегося фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта по ферментативной активности, инкубирование фермента проводят в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида и конкурентных в отношении формиата ингибиторов фермента, устанавливая при этом молярное соотношение ферментникотинамидадениндинуклеотид окисленный, равным 1:2-215 и концентрацию ингибитора, равной 12, 3 — 1430 константам ингибирования.